元宝枫翅果3种活性成分及抗氧化能力研究

王 瑶，牛立新，白章振，张晓骁，张延龙，王 宁

(西北农林科技大学 风景园林艺术学院，陕西 杨凌 712100)

元宝枫(AcertruncatumBunge.)为槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer)植物，因翅果形状像中国古代“金锭元宝”而得名，在我国分布范围广，是我国特有树种[1]。元宝枫不仅具有观赏价值，还具有油用价值。元宝枫种仁中含油量达42%～48%[2-3]，油中不饱和脂肪酸占90%以上[1]，且含有约5.8%的特殊脂肪酸——神经酸，脂溶性维生素E含量高达125.23 mg/100 g[4]，具有良好的抗菌、抗肿瘤作用[5-6]。2011年3月，我国卫生部批准元宝枫籽油作为新资源食品，使元宝枫成为我国重要木本油料资源。果翅、种皮和提取油脂后的仁粕，是元宝枫籽油生产过程中的副产物。果翅中含有单宁、槲皮素、山柰酚、异鼠李素[7]，种皮中含有大量的缩合单宁[8]，种仁中含有多种多酚类物质[9]。这些天然活性物质属于植物次级代谢过程中的重要产物，能够通过清除过多的自由基，从而避免机体损伤，避免多种疾病的发生，对于延长食品保质期和促进人体健康有着非常重要的作用[10]。目前，对元宝枫翅果不同部位活性物质含量和抗氧化能力尚缺乏系统研究，弄清有关问题对于进一步充分综合利用元宝枫果实有着重要的作用。

本研究在对元宝枫果翅、种皮及仁粕中总酚、缩合单宁、总黄酮含量比较分析的基础上，对其FRAP抗氧化能力、对DPPH自由基和ABTS+·的清除作用进行了分析研究，为元宝枫翅果综合利用提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

元宝枫翅果于2017年11月8日采自陕西省杨陵区西北农林科技大学校园内，采后将果翅、种皮和种仁分开，38℃烘干后粉碎，过60目筛，密封保存于4℃备用。种仁采用超临界CO2充分萃取油脂后得到仁粕，密封保存于4℃备用。

乙醇、甲醇、冰醋酸、盐酸、三氯化铁，均为分析纯；福林酚试剂；无水碳酸钠、亚硝酸钠、结晶氯化铝、盐酸、香兰素、醋酸钠，均为分析纯；水溶性维生素E(Trolox)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、没食子酸、芦丁、儿茶素标准品，均为色谱纯，美国Sigma公司。

1.1.2 仪器与设备

GENSYS10S紫外可见-分光光度计，美国Thermo公司；SFE-2型超临界CO2萃取仪，美国应用分离公司；RE-52AA 型旋转蒸发仪；SP-Max2300AZ光吸收型全波长酶标仪；101型电热鼓风干燥箱；KQ-500DE型数控超声波清洗器；KDC-140HR高速冷冻离心机；FW-400A高速万能粉碎机。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

分别准确称取0.5 g元宝枫果翅、种皮、仁粕粉末，各加入10 mL 70% 的乙醇，静置3 h后在25℃超声处理50 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，剩余残渣在相同的超声条件下提取2次，合并上清液，旋转蒸发浓缩后用70%的乙醇定容至25 mL，避光密封保存于-20℃冰箱中用于后续实验分析。

1.2.2 总酚含量测定

采用福林酚比色法[11]测定，以没食子酸作为标准品。取稀释至适当浓度的样品提取液0.5 mL于10 mL离心管中，再加入2.5 mL福林酚试剂(0.2 mol/L)，静置5 min后加入2 mL碳酸钠溶液(75 g/L)，混匀，在黑暗处放置1.5 h后在765 nm处测定吸光值。以蒸馏水代替碳酸钠溶液(75 g/L)的反应体系为空白对照，根据标准曲线计算总酚含量，结果表示为每克样品中毫克没食子酸当量(mgGAE/g)。每个样品重复测定3次。

1.2.3 缩合单宁含量测定

采用香草醛盐酸法[12]测定，以儿茶素作为标准品。取稀释至适当浓度的样品提取液1 mL于10 mL离心管中，依次向离心管中加入6 mL 4%的香草醛甲醇溶液、3 mL浓盐酸，混匀，在25℃避光条件下反应30 min后在500 nm处测定吸光值。以甲醇代替4%的香草醛甲醇溶液的反应体系为空白对照，根据标准曲线计算缩合单宁含量，结果表示为每克样品中毫克儿茶素当量(mgCE/g)。每个样品重复测定3次。

1.2.4 总黄酮含量测定

采用氯化铝比色法[13]测定，以芦丁作为标准品。取稀释至适当浓度的样品提取液5.4 mL于10 mL离心管中，依次向离心管中加入0.3 mL亚硝酸钠溶液(0.5 mol/L)、0.3 mL氯化铝溶液(0.3 mol/L)，静置5 min后加入4 mL氢氧化钠溶液(1 mol/L)，4 000 r/min离心2 min后在510 nm处测定吸光值，以蒸馏水代替氯化铝溶液(0.3 mol/L)的反应体系为空白对照，根据标准曲线计算总黄酮含量，结果表示为每克样品中毫克芦丁当量(mgRT/g)。每个样品重复测定3次。

1.2.5 DPPH自由基清除能力测定[14]

称取一定质量的DPPH自由基，以无水乙醇为溶剂，配制成浓度为2.2×10-4mol/L的DPPH自由基溶液，分别取稀释到不同浓度的样品100 μL与100 μL DPPH自由基溶液于96孔酶标板中混合，25℃避光孵育35 min后在517 nm测定吸光值，以相同体积70%的乙醇替换样品作空白对照，结果用DPPH自由基清除率表示。清除50%的DPPH自由基所需要的样品质量浓度用IC50值表示。每个质量浓度测定3次，取平均值。

1.2.6 ABTS+·的清除能力测定[11]

ABTS+·溶液由10 mL ABTS溶液(7 mmol/L)和176 μL过硫酸钾溶液(140 mmol/L)室温避光条件下反应15 h生成，使用时用无水乙醇稀释至溶液在 734 nm 处的吸光值为 0.70±0.02。分别取稀释到不同质量浓度的样品20 μL与 180 μL ABTS+·溶液于96孔酶标板中混合，避光反应 6 min后于734 nm测定吸光值，以相同体积70%的乙醇替换样品为空白对照，结果用ABTS+·清除率表示。清除50%的ABTS+·所需要的样品质量浓度用IC50值表示。每个质量浓度测定3次，取平均值。

1.2.7 FRAP抗氧化能力测定[15]

取稀释到不同质量浓度的样品10 μL与190 μL预热至37℃的FRAP工作液于96孔酶标板中混合，避光反应30 min后于593 nm处测定吸光值，以相同体积70%的乙醇代替样品加入FRAP工作液作为空白对照，以不同质量浓度的Trolox溶液为标样，制作标准曲线(Y=0.004 4X+0.156 1，R2=0.997)。结果以mgTEAC/g表示。每个质量浓度测定3次，取平均值。

1.3 数据分析

采用Origin8.5软件进行作图，通过SPSS23.0进行IC50值的计算、差异显著性分析与相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 活性成分含量(见表1)

表1 元宝枫翅果不同部位总酚、缩合单宁和总黄酮含量

酚类物质是植物次级代谢过程的重要产物，具有较强的抗氧化、抗菌、抗感染等作用[10]。由表1可见，种皮中总酚含量显著高于果翅和仁粕，种皮中总酚含量最高(342.83 mgGAE/g)，其次是果翅(24.11 mgGAE/g)，仁粕中总酚含量最低(2.76 mgGAE/g)，说明元宝枫翅果中的总酚主要存在于种皮中。朱小芳等[16]对平欧榛子不同部位总酚含量进行测定，发现种皮中总酚含量也显著高于种壳和种仁，Bravo[17]指出植物果实外皮是酚类物质的主要聚集部位，与本研究结果一致。

单宁按化学结构可分为水解单宁与缩合单宁，具有镇静、催眠、镇痛、抗凝、止泻等作用，其中缩合单宁被广泛应用于鞣革中[1]。由表1可见，各部位间缩合单宁含量差异显著，种皮中缩合单宁含量高达847.45 mgCE/g，果翅中缩合单宁含量为30.49 mgCE/g，仅为种皮中的3.60%，在仁粕中未检测出缩合单宁。王性炎等[8]采用皮粉振荡法测出元宝枫种皮中单宁含量为60.24%，果翅中单宁含量为7.87%；杨连利等[18]采用络合法测出元宝枫种皮中单宁含量为686.10 mg/g，由此可以看出元宝枫种皮富含单宁，具有重要的开发价值。

黄酮类化合物为植物体多酚类代谢物，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎症、抗过敏、抗心血管疾病及抗糖尿病并发症等药理作用[19]。由表1可见，总黄酮含量从高到低依次为种皮(57.66 mgRT/g)>果翅(11.58 mgRT/g)>仁粕(2.48 mgRT/g)，种皮中的总黄酮含量是果翅中的4.98倍，是仁粕中的23.25倍。由此可知翅果中黄酮类化合物主要存在于种皮中，这可能是因为其暴露于外部环境中，光照、温度、水分等条件促使其合成更多的黄酮类化合物[20]。

2.2 抗氧化能力

2.2.1 对DPPH自由基清除能力(见图1)

由图1可知，元宝枫翅果不同部位样品提取物对DPPH自由基均具有一定的清除作用，在一定质量浓度范围内清除能力随着提取物质量浓度的增加而增加，呈现出较好的量效关系，但当各样品提取物到达一定质量浓度后，样品对DPPH自由基的清除率渐渐趋于平缓。以IC50值衡量翅果不同部位提取物抗氧化能力，IC50值越小，对DPPH自由基的清除能力越高，抗氧化能力越强。由图1可知，样品提取物IC50值大小为种皮(16.62 μg/mL)<果翅(244.52 μg/mL)<仁粕(10 110.17 μg/mL)，对照Trolox的IC50值为17.90 μg/mL，说明种皮具有最高的DPPH自由基清除能力，且高于对照Trolox，而果翅和仁粕提取物对DPPH自由基的清除能力显著低于种皮和Trolox。

2.2.2 对ABTS+·清除能力(见图2)

由图2可知，元宝枫翅果不同部位样品提取物对ABTS+·均具有良好的清除作用，但清除能力差异显著，在一定质量浓度范围内，ABTS+·清除率随着样品质量浓度的增加而增加，达到一定质量浓度后ABTS+·清除率增加得越来越慢。翅果不同部位样品提取物IC50值从小到大依次为种皮(80.00 μg/mL)<果翅(828.03 μg/mL)<仁粕(12 431.95 μg/mL)，对照Trolox的IC50值为 57.98 μg/mL，样品提取物对ABTS+·的清除能力均小于Trolox。种皮、果翅和仁粕的清除能力存在显著性差异，种皮的清除能力显著高于果翅和仁粕，这与翅果不同部位样品提取物对DPPH自由基清除作用结果一致。

2.2.3 FRAP抗氧化能力(见表2)

表2 元宝枫翅果不同部位及对照FRAP抗氧化能力

由表2可见，果翅、种皮、仁粕均具有抗氧化活性，抗氧化能力最强的是种皮，其FRAP抗氧化能力达到了690.74 mgTEAC/g,其次是果翅，FRAP抗氧化能力为50.82 mgTEAC/g，仁粕的抗氧化能力最弱，FRAP抗氧化能力只有3.66 mgTEAC/g，种皮的FRAP抗氧化能力是果翅的13.60倍，是仁粕的188.70倍。这与DPPH自由基清除能力实验、ABTS+·清除能力实验得到的结果一致。

2.3 翅果抗氧化能力与3类活性成分含量相关性分析

由2.1和2.2分析可知，元宝枫翅果各部位活性成分含量从高到低为：种皮>果翅>仁粕，抗氧化能力强弱为：种皮>果翅>仁粕。总酚、缩合单宁和总黄酮均具有一定的抗氧化能力，且其含量的高低与抗氧化能力具有一定的相关性。如表3所示，元宝枫翅果不同活性成分与不同抗氧化能力评价方法之间存在着不同的相关性，样品提取物对DPPH自由基清除作用与总酚含量和缩合单宁含量呈显著正相关，相关系数分别为0.694和0.782，与总黄酮含量的相关系数只有0.078，说明在清除DPPH自由基的过程中，总酚和缩合单宁起着主要作用；样品提取物中总酚含量与ABTS+·清除能力的相关系数最高，为0.930，呈显著正相关，缩合单宁含量和总黄酮含量与ABTS+·清除能力的相关系数分别为0.467和0.649，说明在清除ABTS+·的过程中，总酚贡献最大；样品提取物的FRAP抗氧化能力与总酚、缩合单宁含量呈显著正相关，3类活性成分的贡献大小依次为总酚>缩合单宁>总黄酮。3种抗氧化能力评价结果均表明，翅果提取物中总酚与缩合单宁含量与抗氧化能力呈显著正相关，因此推测种皮抗氧化能力强是因为其中含有大量的缩合单宁与总酚。

表3 元宝枫翅果抗氧化能力与3类活性成分含量相关性

注：*表示0.05级别(双尾)相关性显著，**表示0.01级别(双尾)相关性显著。

3 结 论

元宝枫翅果的果翅、种皮、仁粕中的3种活性成分含量和抗氧化能力存在显著性差异，且种皮中活性成分含量最高，其总酚、缩合单宁、总黄酮含量分别为342.83 mgGAE/g、847.45 mgCE/g、57.66 mgRT/g，抗氧化能力显著高于果翅和仁粕，具有较高的应用潜力。可将种皮进行深加工，应用于食品、保健医药、化妆品等行业，提高元宝枫果实的应用价值。