B 族维生素抑制NLRP3 炎性小体活化减轻PM2.5致孕鼠脑损伤

孙丽娟，王婷婷，吕莹，杨瑞，李晓双，于丽

（潍坊医学院组织学与胚胎学教研室，山东省神经疾病与再生修复重点实验室，潍坊 261053）

PM2.5（空气动力学直径不超过2.5μm 的颗粒物质）是空气污染的主要成分，可对人类健康构成严重危害。孕妇及其胎儿属于非常脆弱的群体，特别容易受到空气污染物的影响。妊娠期暴露于高浓度PM2.5环境会引起母体炎症反应及不良妊娠结局[1，2]。近期研究表明，PM2.5与中枢神经系统（CNS）疾病的发生密切相关，而神经炎症可能是PM2.5引起神经损伤的主要机制之一[3]。NOD 样受体热蛋白结构区域3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3）炎性小体是一种在中枢神经系统中大量表达的亚细胞多蛋白复合物，被认为是神经炎症发展的关键因素[4]。研究表明，补充B 族维生素可以减少PM2.5对心脏自主神经功能障碍和炎症标志物的急性作用[5]。而B 族维生素是否可通过抑制NLRP3炎性小体通路减轻PM2.5所致孕妇神经炎症和脑损伤，目前尚不明确。

本研究建立了孕期PM2.5损伤动物模型，并给予B 族维生素干预，探讨NLRP3 炎性小体在VB 干预孕期PM2.5致神经炎症中的表达变化，将为寻找减轻 PM2.5污染所致孕妇脑损伤提供一种新的营养干预手段。

材料与方法

1 PM2.5 标本的采样和处理

使用大气颗粒物采样器，收集2017 年12 月至2018 年1 月采暖季某地级市城区大气PM2.5，制备样品的方法参考课题组前期的研究[6]。将颗粒物过滤膜切成小块，在低温下用去离子水处理。超声波振荡四次（每次30min）。然后收集洗脱液并在真空中冷冻干燥，将冷冻干燥的粉末保存在-20℃，使用时以PBS 为溶剂配成需要的浓度，超声振荡混匀。

2 实验动物和模型制备

SPF 级 ICR（Institute of Cancer Research）小鼠，8-9 周龄，购于山东省济南实验动物中心。饲养条件：自由饮水进食，室温25℃左右。

将雌雄小鼠按2：1 合笼，次日雌鼠查出阴栓者即为妊娠第一天 (E0.5) 。将孕鼠随机分为对照组、模型组和干预组。对照组（control）：给予PBS 灌胃；模型组（PM2.5）参照课题前期方法[7]气管滴注浓度为3.456 µg/µl 的30 µl PM2.5混悬液（相当于2016 年冬季某地区PM2.5最高值1000 μg/m3），PBS灌胃；干预组（PM2.5+VB）：气管滴注相同剂量的PM2.5混悬液，VB 灌胃[叶酸：0.6 mg/（kg·d）、维生素B6：11.4 mg/（kg·d）、维生素B12：0.2 mg/（kg·d）]，VB 混合液的制备参考文献根据人的剂量等效换算为小鼠[16]。从妊娠期第1d 开始，每天进行灌胃(E0.5-E17.5)。

3 荧光定量逆转录PCR

待孕鼠分娩后，分离其大脑皮层，匀浆，TRIzol试剂提取总RNA 并逆转录。使用第一链cDNA 合成试剂盒合成cDNA。在cfx-manager 3.1 系统上，使用SYBR 预混料Ex Taq II 试剂盒进行实时RT 聚合酶链反应（PCR）。用2-ΔCT 法测定mRNA 的变化。NLRP3、IL-1β 和caspase-1 逆转录和扩增反应参考之前的程序进行[7]，引物由上海生工生物工程股份有限公司提供（表1）。

表1 RT-PCR 引物序列Tab. 1 Primer Sequences for RT-PCR

4 Western blot

孕鼠分娩后，分离其大脑皮层，加入RIPA 裂解液提取蛋白质，12% SDS-PAGE凝胶电泳。300 mA恒流转膜。5%脱脂奶粉封闭2h，一抗孵育4 ℃过夜：兔源NLRP3 多克隆抗体（1∶200），兔源的cleaved caspase-1 多克隆抗体（1∶200），兔源GAPDH 单克隆抗体（1∶2000）。TBST 洗涤，加入HRP 标记羊抗兔IgG（1∶2000），室温孵育2h。ImageJ 凝胶分析工具定量分析条带光密度。样本中目的蛋白的含量以目的蛋白光密度值/GAPDH 光密度值反映。

5 炎性因子的ELISA 检测

分离孕鼠大脑皮层，提取蛋白，标准品和样品中的IL-1β 与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠IL-1β，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，检测450nm 处的OD值，基于标准曲线计算IL-1β 的浓度。

6 免疫荧光染色

孕鼠分娩后，用5%的水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，完整剥离鼠脑，制备15μm 冰冻切片。PBS 洗片5min×3 次，微波抗原修复，10%羊血清37℃封闭1h，一抗孵育4 ℃过夜：兔源NLRP3多克隆抗体（1∶150），兔源cleaved caspase-1 多克隆抗体（1∶200），根据一抗种属滴加Alexa Fluor 488 标记的羊抗兔 IgG（1∶200)，37 ℃避光孵育1h，Hoechest 染核，37 ℃孵育25min，封片观察。

7 统计学分析

实验数据均为均数± 标准误表示，应用SPSS22.0 统计软件处理数据。采用单因素方差分析（ANOVA），采用Tukey 检验进行组间两两比较。P＜0.05 被认为具有显著性差异。

结 果

1 B 族维生素干预降低PM2.5 暴露对孕鼠大脑皮层NLRP3 和caspase-1、IL-1β 转录的上调

实时荧光定量PCR 结果显示：给予PM2.5暴露后，模型组孕鼠大脑皮层NLRP3、IL-1β mRNA 表达水平明显高于对照组；PM2.5暴露同时给予VB 干预，干预组孕鼠大脑皮层NLRP3、IL-1β mRNA 表达水平则明显低于模型组，但与对照组相比无明显变化（图1A、B）。各组总caspase-1 的转录水平无明显差异（图1C）。

2 B 族维生素干预降低PM2.5 暴露对孕鼠大脑皮层NLRP3 和cleaved caspase-1 水平的上调

Western blot 结果显示：给予PM2.5暴露后，模型组孕鼠大脑皮层中NLRP3 和cleaved caspase-1 的蛋白表达明显高于对照组；PM2.5暴露同时给予VB干预，干预组孕鼠大脑皮层中NLRP3 和cleaved caspase-1 的蛋白表达明显低于模型组，但与对照组相比变化不明显（图1E-H）。

免疫荧光结果显示：NLRP3 和cleaved caspase-1均表达于大脑皮层细胞的胞质内，模型组孕鼠大脑皮层NLRP3 和cleaved caspase-1 免疫反应阳性细胞数及荧光强度均强于对照组；B 族维生素干预组孕鼠大脑皮层NLRP3 和cleaved caspase-1 免疫反应阳性细胞数及荧光强度均弱于模型组，但与对照组相比无明显差异（图2）。

3 B 族维生素干预降低PM2.5 暴露对孕鼠大脑皮层炎性因子IL-1β 水平的上调

ELISA 检测发现：给予PM2.5暴露后，模型组孕鼠大脑皮层IL-1β 表达量明显多于PBS 对照组；PM2.5暴露同时给予VB 干预，干预组孕鼠大脑皮层IL-1β 的表达量明显低于模型组，但与对照组相比无显著差异（图1D）。

讨 论

细颗粒物（PM2.5）是一种对全球公共健康构成重大危害的空气污染物。越来越多的证据表明，PM2.5暴露不仅会损害大脑，加速认知老化，而且可诱导小鼠脑损伤，增加氧化应激和炎症反应，加重小鼠大脑神经炎症[8-10]。据报道，妊娠期暴露于PM2.5会导致促炎因子表达增加，引起孕鼠全身炎症反应，而炎症已被确定为多种神经疾病的致病因素[17,18]。研究表明NLRP3 炎性小体通路参与了神经疾病，NLRP3 炎性小体是一种调节IL-1β 前体分裂的胞质多蛋白复合物，可以导致caspase-1 的活化，其过度激活可能导致各种疾病的发生和发展[11,12]。

本课题组前期研究发现，妊娠期大气细颗粒物暴露致孕鼠多种器官出现炎症等病理损害[13]。为阐明颗粒物暴露致孕鼠脑损伤的炎症通路，我们检测了孕鼠大脑皮层NLRP3 炎性小体通路相关因子的表达变化。结果发现，PM2.5暴露后孕鼠大脑皮层NLRP3、IL-1β mRNA 表达水平明显升高，且PM2.5模型组的NLRP3、cleaved caspase-1 和IL-1β 的蛋白表达明显高于对照组。结果表明妊娠期暴露于PM2.5可能导致孕鼠NLRP3 炎性小体通路被激活，可进一步引起下游因子caspase-1 的活化，活化的caspase-1可促进最终产物IL-1β 加工并驱动炎症反应和细胞焦亡的发生，进而导致脑损伤。研究发现，NLRP3炎性小体是一种亚细胞多蛋白复合物，其形成和活化可能由多种物质诱导，活化的NLRP3 炎性小体激活caspase-1，促进炎性细胞因子IL-1β 的分泌，并诱导细胞焦亡[14]，这与我们上述结果是一致的。因此，NLRP3 炎性小体在中枢神经系统炎症反应的发展中起着至关重要的作用。

图1 各组孕鼠大脑皮层中NLRP3、IL-1β 和caspase-1 表达水平检测。A-C， NLRP3、IL-1β、caspase-1 mRNA 含量；D，IL-1β 表达量；E和F， NLRP3 和cleaved caspase-1 含量；G 和H，NLRP3 和cleaved caspase-1 相对水平的统计学分析。*，P＜0.05；**，P＜0.01；n=3Fig. 1 Detection of expression levels of NLRP3, IL-1β and caspase-1 in the cerebral cortex of pregnant mice in each group. A to C, mRNA levels of NLRP3, IL-1β, caspase-1; D, expression level of IL-1β; E and F, protein levels of NLRP3 and cleaved-caspase-1; G and H, statistical analysis for relative levels of NLRP3 and cleaved caspase-1; *, P＜0.05；**, P＜0.01；n=3

图2 各组孕鼠大脑皮层NLRP3、cleaved caspase-1 表达的免疫荧光检测。A1、B1、C1，对照组、模型组、干预组孕鼠大脑皮层NLRP3 的表达情况。A2A3、B2B3、C2C3，分别为A1、B1、C1 中方框内放大图像。D1、E1、F1，对照组、模型组、干预组孕鼠大脑皮层cleaved caspase-1 的表达情况。D2D3、E2E3、F2F3，分别为D1、E1、F1 中方框内放大图像。比例尺：A1-C1, 50μm; A2-C2 和 A3 -C3, 25μm；D1-F1, 50μm；D2 -F2 和D3- F3, 25μmFig. 2 Immunofluorescence detection for expression of NLRP3 and cleaved caspase-1 in the cerebral cortex of pregnant mice. A1, B1, C1, the expression of NLRP3 in the cerebral cortex of the control group, the model group and the intervention group. A2A3、B2B3、C2C3 are respectively the enlarged images in the box of A1, B1 and C1. D1, E1, F1, the expression of cleaved caspase-1 in the cerebral cortex of pregnant rats in the control group, model group and intervention group. D2D3, E2E3, F2F3 are respectively the enlarged images in the boxes of D1, E1 and F1. Scale bar∶ A1 to C1, 50μm; A2 to C2 and A3 to C3, 25μm; D1 to F1, 50μm；D2 to F2 and D3 to F3, 25μm

少量人体研究表明，环境PM2.5暴露对机体的某些不利影响可能通过补充B 族维生素来中和[16]，但确切机制及是否可以预防PM2.5暴露所致脑损伤，目前尚不明确。B 族维生素被认为具有抗炎、抗氧化的特性和免疫表观遗传效应[17]，因而我们推测B族维生素可能对空气污染引起的疾病也有一定的保护作用。本研究建立了妊娠期B 族维生素干预PM2.5损伤动物模型，探讨B 族维生素是否可作为营养干预措施缓解PM2.5所致的孕鼠脑损伤。我们的结果显示，孕期给予一定的B 族维生素干预后，暴露于同样的PM2.5环境，孕鼠大脑皮层NLRP3、cleaved caspase-1 的表达受到抑制，炎性因子IL-1β 的表达明显降低，说明神经炎症得到缓解。可见，妊娠期B族维生素补充后，可以抑制PM2.5暴露所致孕鼠大脑皮层NLRP3 炎性小体相关因子的表达，神经炎症损伤得到改善，趋近于正常水平。因此，我们推测，B族维生素可减轻孕期PM2.5暴露诱导的孕鼠神经炎症，对PM2.5暴露所致的孕鼠脑损伤有保护作用，可能通过抑制NLRP3 通路的激活缓解脑损伤。

综上所述，孕期PM2.5暴露可导致孕鼠大脑皮层NLRP3 炎性小体通路的激活，参与神经炎症的发生，而B 族维生素可能通过抑制NLRP3 炎性小体通路激活，从而减少炎性因子的合成和分泌。因此我们应该针对孕妇开展形式多样的健康教育，从而保证妊娠期B 族维生素正常摄入, 有效预防和治疗孕妇神经炎症，降低不良环境因素导致的孕妇脑损伤发生率，促进胎儿正常发育。