类风湿关节炎患者外周血单核细胞lncRNA差异表达谱研究

刘健 万磊 孙玥 章平衡 忻凌 姜辉 方妍妍 董文哲 文建庭

【摘 要】目的：观察类风湿关节炎患者外周血单核细胞lncRNA差异表达。方法：选取安徽中医药大学第一附属医院住院类风湿关节炎患者（类风湿关节炎组）及健康体检者（正常对照组），每组3例。抽取2组研究对象的外周血，利用高通量基因测序技术检测外周血单个核细胞lncRNA和mRNA表达，GO分析及KEGG信号通路分析差异表达的lncRNA功能分布，构建lncRNA-mRNA的共表达网络，并在此基础上通过Cis和Trans预测可能与类风湿关节炎凋亡、氧化应激、信号通路相关lncRNA。利用RT-PCR方法验证lncRNA。结果：通过lncRNA测序分析发现，lncRNA在类风湿关节炎组与正常对照组存在明显差异表达。共有9158条差异表达的lncRNA（差异倍数≥2，且P≤0.05），表达上调的有5682条，下调的有3476条;差异表达的mRNA共有7895条。GO分析发现，差异表达的mRNA主要参与免疫炎症反应、细胞凋亡、氧化应激、细胞代谢、细胞转录调节、骨髓白细胞活化、血小板细胞活化等。KEGG信号通路分析发现，差异表达的mRNA主要参与类风湿关节炎、细胞衰老、信号通路等方面。通过RT-PCR验证发现，与类风湿关节炎相关的细胞凋亡lncRNA为ENST00000619282、ENST00000637683、ENST00000511703，氧化应激为HOTAIRM1、DANCR，Notch通路为MALAT1、CARMN、LINC-PINT。结论：类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞中差异表达的lncRNA异常表达，可能与类风湿关节炎细胞凋亡、氧化应激及信号通路失衡有关。

【关键词】 关节炎，类风湿;长链非编码RNA;细胞凋亡;氧化应激;Notch信号通路;高通量基因测序

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种累及周围关节为主的多系统性、炎症性的自身免疫性疾病[1-2]。RA疾病发生发展过程中伴随着机体免疫细胞增殖和凋亡动态的失衡，氧化应激激活及包括Notch通路在内的多种信号传导通路失衡，导致免疫炎症的发生，最终促进RA疾病的发生发展[3-4]。RA发病机制目前仍不明确。随着近年来高通量基因测序技术的发展，对于RA基因表达谱的研究越来越受到学者关注。研究发现，长链非编码RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）可能在RA的发病过程中起到相当重要的作用。lncRNA可能在RA机体的滑膜细胞凋亡、免疫炎症、氧化应激及信号通路传导失衡过程中起到重要作用。lncRNA是由非编码序列转录生成的长度 > 200 nt的RNA，目前尚未发现它翻译成蛋白质的功能。但是它可以通过与其他基因特异性结合，或与蛋白质形成复合物，从而发挥多种生物学功能。研究发现，RA患者中差异表达的lncRNA共有1615条[5]，RA患者外周血單个核细胞（PBMCs）中呈异常表达的lncRNA有242个[6]。因此，通过观察lncRNA在RA中表达差异的变化，从而可以把lncRNA作为靶向治疗靶点以达到缓解甚至治愈RA的目的。本研究采用高通量基因测序技术筛选正常人和RA患者外周血淋巴细胞lncRNA表达谱，分析lncRNA差异表达情况，并探讨RA与lncRNA的关系，为RA寻找新的治疗靶点提供依据。

1 资 料

1.1 临床资料 选取2018年9月至2018年11月在安徽中医药大学第一附属医院就诊的住院RA患者（RA组）3例，年龄40～55岁;均符合美国风湿病学会（ACR）2010年RA诊断标准。另选同期3例健康体检者为正常对照组（NC组），年龄35～55岁。本研究获医院伦理委员会批准及患者及健康对照人群的知情同意（伦理号2018AH-19）。

1.2 主要试剂和仪器 胎牛血清（四季青）;人淋巴细胞分离液（南京三生生物技术股份有限公司生产）;RNA提取试剂（Thermo Fisher Scientific公司）;RT-qPCR试剂盒（上海近岸科技有限公司）;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，测序、图像采集、数据分析由雨希生物科技（上海）有限公司完成。

2 方 法

2.1 细胞收集 采集RA组和NC组外周静脉血10 mL，离心。利用淋巴细胞分离液进行分选，血细胞分析仪进行细胞计数及淋巴细胞的纯度检测。下层血细胞用淋巴细胞分离液梯度离心，分离获得PBMCs用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤细胞，-80 ℃冻存备用。

2.2 测序类型的选择 采用测序平台的双端151 bp测序模式对样本进行去核糖体rRNA的RNA测序，利用软件对测序数据从3'端动态去除接头序列片段和低质量片段，利用软件对预处理数据进行质量控制分析以及统计Q20、Q30的碱基比例。然后去除第1端序列前5 bp，采用软件将预处理数据依次比对于rRNA序列数据库。可同时对lncRNA和mRNA进行检测，并挖掘出两者的关联。

2.3 总RNA提取 分别提取RA组和NC组淋巴细胞中的总RNA后，纯化总RNA。琼脂糖凝胶电泳，对总RNA进行定量和质量分析。

2.4 lncRNA表达谱分析 对3例RA患者和3例健康体检者进行高通量基因测序分析。lncRNA表达谱分析由雨希生物科技（上海）有限公司完成。针对mRNA和lncRNA转录本，根据样本的实验设计，利用软件对不同样本组之间筛选差异表达的转录本。靶基因转录本（GO）分析描述差异表达的mRNAs功能属性。京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路分析差异表达mRNAs生物学途径。顺势（Cis）、反式（Trans）靶标预测可能与RA 发生相关的lncRNA。

2.5 RT-PCR验证 以3例RA患者和3例健康体检者为研究对象，在筛选出来的差异表达lncRNA中，挑选差异倍数较大的lncRNA，以内参（β-actin）作为参照，采用荧光染料掺入相对定量法进行RT-qPCR验证。引物序列见表1。按照RNA提取说明提取RA组和NC组RNA，反转录cDNA及PCR扩增，最后计算2-△△CT。

3 结 果

3.1 总RNA样本质量分析 通过采用illuminaNovaseq6000测序仪检测，对每个RNA样本的碱基位置、长度等分析，均达到质检标准，能够满足实验需要。

3.2 差异表达的lncRNA和mRNA 通过lncRNA测序分析发现，lncRNA在RA组与NC组存在明显差异表达。共有9158条差异表达的lncRNA（差异倍数≥2，且P≤0.05），表达上调的有5682条，下调的有3476条;差异表达的mRNA共有7895条。

分别对其中表达上调、下调倍数最明显的20条lncRNA和mRNAs进行聚类分析图显示，可直观地看到2组lncRNAs与mRNAs的表达差异，同组样本聚在一起，说明样本间基因表达趋势一致。红色到绿色，颜色越深代表差异越明显。

3.3 生物信息学分析 GO分析发现，差异表达的mRNA主要参与免疫炎症反应、细胞凋亡、氧化应激、细胞代谢、细胞转录调节、骨髓白细胞活化、血小板细胞活化等功能。KEGG信号通路分析显示，差异表达的mRNA主要参与RA、细胞衰老、信号通路等方面功能的基因有显著变化。并在此基础上经Cis、Trans预测，RA细胞凋亡方面，与B细胞淋巴瘤（BCL）2L14、BCL2L13、核转录因子-κB1（NF-κB1）、信号通路（Notch通路）密切相关的mRNA为白细胞介素（IL）-15、IL-6、人白细胞抗原DRB5（HLA-DRB5）等。因此与之相关的lncRNA细胞凋亡为ENST00000619282、ENST00000637683和ENST00000511703;氧化应激为HOTAIRM1、DANCR;Notch通路为MALAT1、CARMN、LINC-PINT。

3.4 qRT-PCR对lncRNA验证

3.4.1 细胞凋亡相关 lncRNA验证 选取与RA关系密切却差异表达较为显著的lncRNA（主要包括ENST00000619282、ENST00000637683和ENST00000511703）进行PCR扩增验证，结果显示，与高通量测序检测结果一致，ENST00000619282、ENST00000637683表达上调，ENST00000511703下调。

3.4.2 氧化应激相关lncRNA验证 选取与RA氧化应激方面关系最为密切且表达差异较为显著的lncRNA HOTAIRM1、DANCR进行PCR扩增验证。结果显示与基因测序结果一致。

3.4.3 Notch通路相关lncRNA验证 选取差异表达较多的MALAT1、CARMN、LINC-PINT对测序结果进行实时荧光定量PCR验证。3条lncRNA在验证时发现，CARMN、LINC-PINT在RA组与NC组中差异无统计学意义（P > 0.05），MALAT1组间比较显示，RA组MALAT1较NC组降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。lncRNA MALAT1得到了较好的验证。

4 讨 论

RA病因病机尚不明确，其高致残率引起了社会的广泛关注。大部分RA患者在确诊时全身多个关节己经出现破坏，失去了最佳治疗时期。因此，RA早期诊断显得尤为必要。

研究发现，lncRNA在肿瘤[7]、心脑血管[8]、自身免疫[9]等多种疾病中发挥着重要作用。目前研究认为，RA发病与机体的各种免疫细胞如单核细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞水平失衡有关。免疫细胞活化过程与lncRNA水平密切相关，lncRNA能够调控免疫细胞的分化、分泌、凋亡、增殖等多种生物功能[10-12]。

lncRNA在RA病理生理过程中发挥的作用越来越大。RA患者是否存在差异表达的lncRNA？本研究发现，RA组与NC组共有9158条差异表达的lncRNA，上调的有5682条，下调的有3476条，差异表达的mRNA共有7895条，说明RA体内存在差异表达的lncRNA。进一步通过差异表达高倍lncRNAs与mRNAs的分析发现，mRNA主要与免疫炎症反应、细胞转录调节、细胞代谢、骨髓白细胞活化、血小板细胞活化等功能有关。KEGG信号通路分析显示，差异表达的mRNA主要参与RA、细胞凋亡、氧化应激、Notch信号通路等方面。

lncRNA在RA免疫炎症、细胞凋亡、氧化應激和信号通路传导失衡等过程起到重要作用。RA中过表达的lncRNA HOTAIR能够抑制miR-138引起细胞增殖和炎症反应，调节lncRNA HOTAIR能够明显抑制NF-κB信号通路的活化，导致IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）下调，从而抑制免疫炎症反应[14]。研究证明，RA疾病的发展与CD4+T细胞的凋亡异常有关[15-16]。RA外周血中Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3、BCL2-Associated X的蛋白质（Bax）mRNA相对表达降低，Bcl-2升高[17]。前期临床研究发现，RA患者外周血CD4+T细胞凋亡缺陷相关Bcl-2 mRNA与RA疾病密切相关[17-18]，本研究通过高通量基因技术筛选RA患者外周血淋巴细胞中异常表达的lncRNAs，找出3个表达差异比较显著的lncRNA与RA外周血淋巴细胞凋亡相关。进一步观察发现，lncRNA ENST00000619282、ENST00000637683和ENST00000511703可能参与了RA细胞凋亡的过程，并通过验证结果与高通量基因测序结果一致。因此，lncRNA可能竞争性结合某些凋亡因子，调控细胞凋亡水平，促进CD4+T细胞凋亡逃逸，导致RA免疫炎症反应。RA氧化应激中过氧化导致一系列炎性细胞因子浸润、蛋白酶分泌增加、产生大量氧化产物[19]。而RA患者线粒体膜因氧化应激去极化的过程，有利于线粒体的内容物大量进入胞质，参与自身抗体的产生，成为炎症反应中的重要环节[20]。lncRNA在氧化应激中发挥着重要作用，参与广泛细胞过程的调节，lncRNA与细胞衰老、氧化应激相关疾病的发生和维持有关。lncRNA HOTAIR能够调节NF-κB信号通路，影响RA氧化应激和免疫炎症反应[21]。本研究观察与氧化应激密切相关的lncRNA HOTAIRM1、DANCR在RA患者单核细胞表达显著增高，可能参与了RA的发生，并通过QRT-PCR方法进行验证，结果与基因测序结果一致。Notch信号通路在RA发病中起重要作用，其过激活可导致RA滑膜炎症反应加重。本研究结果显示，lncRNA MALAT1参与RA发病过程，与PAN等[22]研究结果相似。lncRNA MALAT1可通过调节miRNA表达影响Notch通路，lnc-MALAT1募集pre-miR-155剪接因子至细胞核内基因转录位点，调控靶基因表达[23]，从而抑制血管内皮细胞异常增殖、分化功能减弱。进一步激活Notch通路，从而导致RA滑膜炎症及骨质破坏。

綜上所述，本研究通过高通量基因测序技术发现了RA外周血淋巴细胞中存在差异表达的lncRNAs，但其中大部分lncRNA的生物功能尚不可知。今后笔者将继续深入研究RA凋亡、氧化应激、Notch信号通路相关lncRNA，并发掘与lncRNA相关的miRNA，研究两者之间的关系，以期为RA疾病的有效治疗提供新的依据和靶点。

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收稿日期：2018-12-15;修回日期：2018-12-31