姜黄素对胃癌细胞增殖、迁移及Hsp90/JAK/STAT3通路的影响

李 磊，陈志武

胃癌发病率在我国各种恶性肿瘤中位居首位[1]。幽门螺旋杆菌感染、工作压力增大以及生存环境改变等原因使患胃癌的人呈现年轻化趋势。很多胃癌早期症状不明显，造成胃癌早期诊断率低下[2]。目前胃癌的治疗以手术切除为主，并辅助放化疗治疗，所以寻找高效的抗肿瘤药物尤为重要。侵袭和转移是恶性肿瘤治疗失败的主要原因，有效控制肿瘤的侵袭和转移是治疗的关键。姜黄素具有抗肿瘤作用，可影响肿瘤发生、发展的各个阶段，且几乎无不良反应[3-4]。美国食品药品管理局已将其作为21世纪抗癌新药[3-4]。该研究以胃癌SGC-7901细胞株为研究对象，探讨姜黄素对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响及其分子机制，揭示了姜黄素对胃癌细胞的作用与作用靶点。

1 材料与方法

1.1实验材料TRIzol试剂、RPMI1640培养基、FBS、CCK8均购自美国Thermo公司；Transwell小室购自美国Corning公司；姜黄素购自上海碧云天生物科技公司；一抗GAPDH、JAK、STAT3及二抗购自美国Abcam公司；胃癌细胞SGC-7901购自中科院上海细胞所。

1.2细胞培养及药物处理首先将复苏的胃癌细胞加入含10%胎牛血清及1%双抗的RPMI 1640培养基，放入恒温培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养。当细胞汇合度达90%左右时消化、传代。将试验细胞分为4组，每组按照1×104/ml的密度接种，并用不同浓度姜黄素(0、15、25、35 μmol/L)分别处理各组细胞并用于后续实验。

1.3CCK8法检测胃癌细胞增殖活性姜黄素处理受试细胞后，选取24 、48 h时间点的细胞，用含有10% CCK8的培养基对细胞进行换液，置于培养箱中继续培养4 h。在酶标仪450 nm波长下测定四组受试细胞的吸光度(optical density，OD)值。

1.4Transwell实验检测胃癌细胞侵袭能力姜黄素处理(0、25、35 μmol/L)胃癌细胞24 h后，胰酶消化，用不含血清的RPMI 1640培养基制备细胞悬液，将细胞悬液加入小室上室，下室加入含有血清的培养液，每组设置3个复孔，保证每个小室内接种的细胞数一致。把细胞板置于恒温培养箱中培养24 h。用棉签擦去上室内未穿膜的细胞后进行结晶紫染色，显微镜下随机选取每个膜上的5个视野计数。

1.5划痕实验检测胃癌细胞迁移能力用姜黄素处理(0、25、35 μmol/L)胃癌细胞24 h后，将细胞接种于细胞板，每组设置3个复孔，培养一段时间。然后采用小枪头在孔底做划线处理，弃去培养基，用PBS清洗被划下的细胞，加入新的培养基置于恒温培养箱中继续培养，24 h后进行拍照。

1.6细胞总RNA的提取及cDNA合成姜黄素处理胃癌细胞24 h后，将1 ml TRIzol加入每孔细胞中进行裂解，将裂解液转移至EP管，向每管加入200 μl氯仿并摇匀，室温放置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。吸取上层水相至新的EP管，加入500 μl异丙醇，室温放置一段时间后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，所得白色沉淀即为RNA。用75%乙醇洗涤RNA 2次，自然晾干后将RNA溶解于DEPC水中。cDNA合成使用TAKARA的One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit，按照说明书指示进行逆转录操作。

1.7实时荧光定量PCR实验实时荧光定量PCR实验在ABI 7300 Real-Time PCR System仪器上按照One Step SYBR® PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TAKARA)说明书进行操作，反应程序为：95 ℃、30 s，40个循环的95 ℃、5 s及 60 ℃、30 s。GAPDH作为内参，实验结果采用2-ΔΔCt表示。相关引物序列及产物大小见表1。

表1 qPCR引物列表

1.8Westernblot实验姜黄素处理胃癌细胞24 h后，毎孔中加入200 μl蛋白裂解液，冰上裂解30 min，将裂解液转入EP管中。12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法测定总蛋白浓度。每组取等量蛋白样品加入适量SDS上样缓冲液，混匀后置于100 ℃水浴锅中加热5 min，变性失活。然后进行凝胶电泳，湿转法将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉中室温孵育2 h，封闭完成后孵育一抗(稀释比为1 ∶1 000)，4 ℃过夜。次日在室温下孵育二抗1 h，TBST洗涤3次，用ECL化学发光显色液显色，凝胶成像设备进行结果观察并拍照，Image J软件进行条带灰度值分析。

2 结果

2.1姜黄素抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖活性姜黄素对胃癌细胞SGC-7901增殖活性的抑制效果见图1。结果显示：测试浓度(15～35 μmol/L)下的姜黄素作用24 h和48 h均能显著抑制胃癌细胞株SGC-7901的增殖水平(P<0.05)，并呈现出明显的浓度依赖性，即随着姜黄素浓度增大，抑制效果增强。

图1 姜黄素对胃癌细胞SGC-7901细胞增殖活性的影响

2.2姜黄素抑制胃癌细胞SGC-7901的侵袭和迁移姜黄素影响胃癌细胞SGC-7901侵袭和迁移的实验结果见图2。结果显示，测试浓度(25、35μmol/L)的姜黄素对受试胃癌细胞的侵袭和迁移均产生了明显抑制作用，且随着姜黄素浓度增大，其抑制效果增强(P<0.05)。

图2 姜黄素对胃癌细胞SGC-7901侵袭与迁移能力的影响

2.3姜黄素处理抑制胃癌细胞增殖相关热休克蛋白90(heatshockproteins，HSP90)、贾纳斯激酶2(januskinase，JAK2)和信号转导因子和转录激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3)基因的表达胃癌细胞SGC-7901经姜黄素处理后，HSP90 mRNA、JAK2 mRNA和STAT3 mRNA的转录水平均显著下降(P<0.05)，且具有明显的浓度依赖性，即随着姜黄素处理浓度的增大，其对细胞中增殖相关基因表达的抑制效果越明显。见图3。

图3 姜黄素对胃癌细胞SGC-7901中相关基因表达的影响

2.4姜黄素处理抑制胃癌细胞增殖相关蛋白HSP90、JAK2和STAT3的表达/激活各浓度姜黄素均未显著影响胃癌细胞JAK2与STAT3表达水平(图4统计图中未展示)。25 μmol/L姜黄素处理对胃癌细胞中HSP90表达、JAK2和STAT3的表达与激活(p-JAK2和p-STAT3)水平没有显著影响。而35 μmol/L姜黄素可导致胃癌细胞中HSP90表达水平、JAK2和STAT3激活水平的显著下调(P<0.01)。见图4。

图4 姜黄素对胃癌细胞SGC-7901中相关蛋白表达的影响

3 讨论

控制癌细胞转移是决定患者预后状况的重要因素[5]。阻断胃癌细胞的转移成为目前医学及生命科学领域急需解决的问题。研究[6]显示，植物中的某些活性化合物，如紫衫烷、姜黄素在肿瘤治疗方面发挥着相关作用。如在结肠癌细胞中，姜黄素衍生物降低了癌细胞的增殖迁移，促进了癌细胞凋亡[7]。本实验检测了不同浓度姜黄素对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响。结果表明，姜黄素显著抑制了癌细胞的增殖，且浓度增加，抑制效果越强。Transwell和划痕试验结果显示，姜黄素也对受试胃癌细胞的侵袭和迁移具有显著抑制作用，且呈现浓度依赖性。这与之前的报道相一致[7-8]。

癌症的发生发展是多因素参与的复杂过程。其中，癌细胞中增殖相关信号通路的异常激活发挥着重要作用，而其显著特点是关键蛋白表达与激活水平的升高[1-2]。JAK2/STAT3 信号通路在多种肿瘤中都有激活。STAT3经磷酸化的方式活化后进入胞核参与调控多种基因的表达，介导肿瘤细胞的增殖、侵袭和血管生成等。抑制JAK活性可抑制STAT3核转位与肿瘤形成。本研究显示，姜黄素处理组(特别是35 μmol/L浓度组)的胃癌细胞内，无论在mRNA水平还是蛋白水平，STAT3及其上游调控蛋白JAK的激活均显著下调，并且这些基因表达与蛋白激活水平的变化也伴随着细胞增殖与侵袭迁移能力的下降。说明姜黄素可能是通过改变胃癌细胞JAK/STAT3信号通路的激活来调控胃癌细胞的增殖、侵袭迁移。在胃癌细胞中，p-JAK及p-STAT3可能是持续高表达的，这对于胃癌的发生、癌细胞的浸润与迁移具有重要的辅助作用[9]。而本研究用35 μmol/L姜黄素处理胃癌细胞24 h后，才出现对p-JAK及p-STAT3的显著抑制效果(但仍然具有较高表达水平)，这可能是由于胃癌细胞对药物具有较强抵抗性。

分子伴侣HSP90在包括胃癌在内的多种恶性实体肿瘤中高表达，参与肿瘤的发生、发展，并与其耐药和不良预后密切相关[10-11]。缺氧诱导因子-1α在多种上皮细胞癌中高表达，参与多种靶基因的转录激活，其中多数蛋白产物可促进血管形成并诱导肿瘤细胞对缺氧的适应，最终促进其转移与侵袭[12]。而HSP90对维持HIF的正确构象或募集其他辅助因子必不可少[13]。HSP90表达也可促进STAT3磷酸化激活，而p-STAT3可促进热休克因子作用于HSP90基因靶点上，从而促进HSP90基因的转录[14]。本研究表明，姜黄素显著抑制了胃癌细胞HSP90的mRNA转录以及蛋白表达水平，说明姜黄素能够通过下调胃癌细胞HSP90来发挥抗肿瘤功效。

本研究揭示了姜黄素可通过抑制胃癌细胞Hsp90-JAK/STAT3信号通路激活来限制其侵袭和迁移，对于胃癌的临床治疗具有一定借鉴意义。但其临床应用效果及安全性等有待进一步研究。