甲胎蛋白免疫测定用国家标准品的建立

孙彬裕，曲守方，于婷，孙楠，孙晶，胡泽斌，黄杰



甲胎蛋白免疫测定用国家标准品的建立

孙彬裕*，曲守方*，于婷，孙楠，孙晶，胡泽斌，黄杰

100050 北京，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所

甲胎蛋白（AFP）是一种血清糖基化蛋白，在正常成人血清中含量极少。AFP 主要由胎儿卵黄囊和肝脏产生，其次是胃肠道黏膜、肾脏也可少量合成。AFP 是单链糖蛋白，分子量 65 ~ 70 kD，其物理化学特性和氨基酸组成类似于血清白蛋白，但抗原性不同[1-3]。作为一种肿瘤标记物，AFP 可以用于肿瘤的诊断疗效监控，70% ~ 95% 的原发性肝癌患者呈现 AFP 水平升高，AFP 异常升高提示原发性肝癌的发生[4-7]。妊娠期可通过 AFP 监测进行疾病的筛查和诊断，产前普查羊水中 AFP 水平可监控胎儿异常，孕妇血清异常升高提示胎儿神经管缺陷畸形，如脊柱裂、无脑儿、脑积水等，AFP 降低提示未出生的婴儿有唐氏综合征的危险性[8-11]。

目前国内外有 70 多家具有注册证的 AFP 测定试剂盒应用于临床，检测方法包括化学发光法、酶联免疫法和时间分辨免疫荧光法等。但各家试剂盒产品质量参差不齐，使用的抗体不同，使其对同一份标本测定的同一肿瘤标记的结果可能会有所差异，导致不同实验室的测定结果不具有可比性[12]。为了解决这一问题，AFP 检测的标准化极为重要。临床实验室测定的标准化关键在于测定结果的量值溯源。实现量值溯源，一般可通过参考方法（或参考测量程序）和标准物质来进行，AFP 没有参考方法，但有国际标准物质[13-14]。而研制 AFP 国家标准品，能够规范我国 AFP 测定试剂盒的质量，促进我国 AFP 检测结果的标准化。本实验室开展了 AFP 国家标准品的研制，并进行协作标定工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 AutoLumo A2000 Plus 全自动化学发光测定仪由郑州安图生物工程股份有限公司提供；Maglumi 2000 Plus 全自动化学发光测定仪由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供；卓越 C1800 全自动化学发光测定仪由上海科华生物工程股份有限公司提供；iMark Bio-Rad 酶标仪由艾康生物技术（杭州）有限公司提供；DR6608 时间分辨荧光免疫分析仪由广州市达瑞生物技术股份有限公司提供；Advia Centaur XPT 和 Immulite 2000 全自动化学发光免疫分析仪由西门子医学诊断产品（上海）有限公司提供；Access 2 全自动免疫分析仪由贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司提供；Cobas e411 电化学发光全自动免疫分析仪由罗氏诊断产品（上海）有限公司提供；Liaison XL 全自动化学发光免疫分析仪由索灵诊断医疗设备（上海）有限公司提供；HISCL-5000 全自动免疫分析仪由希森美康医用电子（上海）有限公司提供。

1.1.2 试剂盒 甲胎蛋白定量检测试剂盒（磁微粒化学发光法）为郑州安图生物工程股份有限公司产品；甲胎蛋白测定试剂盒（化学发光免疫分析法）为深圳新产业生物医学工程股份有限公司产品；甲胎蛋白定量测定试剂盒（化学发光法）为上海科华生物工程股份有限公司产品；甲胎蛋白检测试剂盒（酶联免疫法）为艾康生物技术（杭州）有限公司产品；甲胎蛋白定量测定试剂盒（时间分辨免疫荧光法）为广州市达瑞生物技术股份有限公司产品；甲胎蛋白测定试剂盒（直接化学发光法）和甲胎蛋白测定试剂盒（化学发光法）为西门子医学诊断产品（上海）有限公司产品；甲胎蛋白测定试剂盒（化学发光法）为贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司产品；甲胎蛋白检测试剂盒（电化学发光法）为罗氏诊断产品（上海）有限公司产品；甲胎蛋白检测试剂盒（化学发光免疫分析法）为索灵诊断医疗设备（上海）有限公司产品；甲胎蛋白检测试剂盒（化学发光法）为希森美康医用电子（上海）有限公司产品。

1.1.3 标准品 AFP 国际标准品（Alpha fetoprotein, Human, NIBSC code: AFP，100 000 IU/支）由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 AFP 国家标准品候选品制备 精确量取来源于脐带血提取的甲胎蛋白原料，加至赋形剂（去激素血清）内，充分混匀后，配制成理论浓度约为 900 IU/ml 的 AFP 国家标准品候选品溶液，置于 2 ~ 8℃过夜，次日经 0.22 μm 滤膜无菌过滤，每支安瓿 0.5 ml 进行分装，冻干制备成 AFP 国家标准品候选品。

1.2.2 AFP 国家标准品候选品瓶间精密度实验 随机抽取 10 支候选品，使用郑州安图生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量检测试剂盒（磁微粒化学发光法），平行进行分析测定，计算其效价比的变异系数（CV%）。

1.2.3 AFP 国家标准品候选品热稳定性实验 每次随机选取候选品 2 支，37 ℃放置 1 ~ 12 周后，以–20 ℃保存的 AFP 国家标准品候选品（记为 0 周）为对照，使用郑州安图生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量检测试剂盒，对稳定性候选品样本平行进行分析测定，计算其效价比。

1.2.4 AFP 国家标准品候选品协作标定 在各厂家试剂盒反应体系的线性范围内，以 AFP 国际标准品为对照，对候选品（随机抽取）进行协作标定实验。按各试剂盒说明书进行实验，数据处理采用 Log-log 双对数数学模型进行分析。

1.2.5 AFP 国家标准品候选品一致性研究 收集 20 ~40 份新鲜的临床 AFP 血清样本，肉眼无溶血、脂血和黄疸，浓度范围包含标准物质的浓度且呈现一定的浓度梯度，每个浓度收集 2 ~ 8 ml，500 μl 或 1 ml 分装，–20 ℃以下保存。配制不同浓度的 AFP 国家标准品候选品和国际标准品，然后使用郑州安图生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量检测试剂盒，同时测定 AFP 国际标准品、国家标准品候选品以及上述的血清样本。每个样品的测量结果为该测量系统的测量结果。分别以 AFP 国际标准品和国家标准品候选品为标准曲线，分析血清样本测定的结果，评价 AFP 国家标准品候选品与 AFP 国际标准品的一致性。

2 结果

2.1 AFP 国家标准品候选品瓶间精密度实验

随机抽取 10 支候选品，使用郑州安图生物工程股份有限公司甲胎蛋白定量检测试剂盒平行进行分析测定，AFP 国家标准品候选品 1 ~ 10 瓶间精密度的结果：效价比均值为 1.0283，标准差为 0.014，变异系数为 1.4%（表 1）。结果表明，AFP 国家标准品候选品的瓶间一致性好。

2.2 AFP 国家标准品候选品热稳定性实验

37 ℃放置1 ~ 12 周后，与–20 ℃保存的标准品候选品（作为 0 周）效价比在 0.91 ~ 1.03 之间（表 2）。结果表明，AFP 国家标准品候选品非常稳定。

2.3 AFP 国家标准品候选品协作标定

AFP 国家标准品候选品的免疫活性理论值为 900 IU/支。本次协作研究中，以 AFP 国际标准品为对照品，在各检测系统上测定候选品，用 Log-log 数学模型拟合，要求 AFP 国际标准品与候选品的剂量-反应曲线均不显著偏离平行（检验），并对各试剂盒的标定结果进行统计分析和汇总。若检验结果> 0.05，表明候选品与国际标准品的剂量-反应曲线平行，候选品与 AFP 国际标准品同质。根据 10 个厂家 11 种试剂盒协作标定结果，最终确定 AFP 国家标准品候选品的免疫活性为 930 IU/安瓿（表 3）。

表 1 瓶间精密度实验的结果

表 2 热稳定性实验的结果

表 3 协作标定结果

2.4 AFP 国家标准品候选品一致性研究

在检测系统上同时测定 AFP 国际标准品、国家标准品候选品以及 40 份临床 AFP 血清样本。分别以 AFP 国际标准品和国家标准品候选品为标准曲线，分析临床 AFP 血清样本测定的结果。以临床样本测定结果做散点图，Y 轴为以 AFP 国际标准品为标准曲线测定的结果，X 轴为以 AFP 国家标准品候选品为标准曲线测定的结果，进行线性相关性分析，线性相关系数为 0.9991（图 1）。研究结果表明，AFP 国家标准品候选品与 AFP 国际标准品的一致性很好。

图 1 一致性结果

3 讨论

AFP 测定试剂盒在临床上主要用于原发性肝癌的高危人群的筛查、辅助诊断、疗效和治疗及复发监测等。制定统一的国家标准品有助于使各实验室间的检测结果具有可比性，实现检测标准化。本次协作标定中选用的 AFP 测定试剂盒涉及化学发光、酶联免疫法和时间分辨免疫荧光法，涵盖了我国市场上的主要产品。本次研究以 AFP 国际标准品为对照品，将 AFP 国际标准品与国家标准品候选品的标准曲线进行显著性检验，结果表明国家标准品候选品与国际标准品的剂量-反应曲线平行，国家标准品候选品与 AFP 国际标准品同质，可实现量值传递的追溯性和连续性。

通过对国家标准品候选品的瓶间精密度、热稳定性和一致性研究，此批 AFP 国家标准品候选品能满足作为 AFP 国家标准品的要求，可用于 AFP 免疫分析及相应试剂盒的性能评价。

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*同为第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.015

黄杰，Email：jhuang5522@126.com；胡泽斌，Email：huzbcmba@163.com

2019-01-14