siRNA沉默ADAM10基因对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的影响

王培，楚天舒，阎磊，刘冰，朱清，邵凤民



siRNA沉默ADAM10基因对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的影响

王培，楚天舒，阎磊，刘冰，朱清，邵凤民

450003 郑州，河南省人民医院风湿免疫科（王培、楚天舒），肾病科（阎磊、刘冰、朱清、邵凤民）

探讨小干扰 RNA（siRNA）沉默解整合素金属蛋白酶（ADAM10）基因对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的影响。

将ADAM10 特异性 siRNA 转染人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞 MH7A 细胞，实验分为 3 组，ADAM10-siRNA 组转染 ADAM10 特异性 siRNA，NC-siRNA 组转染 ADAM10 非特异性 siRNA，对照组为未经转染处理的 MH7A 细胞。转染 48 h后采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组细胞中 ADAM10 表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，qRT-PCR 检测凋亡相关基因 B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bax）表达水平，ELISA 测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）含量。

ADAM10-siRNA 组细胞中 ADAM10 mRNA 和蛋白表达水平较 NC-siRNA 组和对照组低（< 0.05）。沉默 ADAM10 基因后，ADAM10-siRNA 组细胞凋亡率显著高于 NC-siRNA 组和对照组（< 0.05）。ADAM10-siRNA 组细胞中 Bax 基因表达水平明显高于 NC-siRNA 组和对照组（< 0.05），Bcl-2 基因表达水平明显低于 NC-siRNA 组和对照组（< 0.05）。ADAM10-siRNA 组细胞分泌的 TNF-α、IL-6 和 IL-8 显著低于 NC-siRNA 组和对照组（< 0.05）。而 NC-siRNA 组和对照组以上各指标相比较，差异不明显（> 0.05）。

沉默 ADAM10 基因可明显促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的凋亡，并进一步减少 TNF-α、IL-6 和 IL-8 等炎症因子的分泌，提示通过沉默 ADAM10 基因使减轻/控制类风湿关节炎炎症成为可能。

关节炎，类风湿； 滑膜成纤维细胞； 解整合素金属蛋白酶 10； 细胞凋亡

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以累及关节为主的慢性全身性系统性自身免疫疾病，其病理特征在于滑膜过度增生，炎性单核细胞浸润，继而造成关节炎症、破坏及功能障碍[1]。越来越多的证据表明，RA 滑膜中存在高度活化的滑膜成纤维细胞（synovial fibroblasts，SFs），SFs 可通过产生促进软骨破坏的促炎症细胞因子（如TNF-α、IL-6 和IL-8 等）和蛋白酶在 RA 发生发展中发挥关键作用[2-3]。近期研究表明，类风湿关节炎滑膜成纤维细胞不但高度活化，释放炎症因子，并且存在凋亡受阻[4]。解整合素金属蛋白酶 10（adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）属于 ADAM 家族成员，是一种跨膜蛋白，参与多种炎性和退行性疾病的发生和发展[5-6]。先前的研究表明 ADAM10 在 RA 滑膜组织中过表达，且在 RA 的滑膜成纤维细胞的增殖及血管生成中起关键作用[7]。据报道，沉默 ADAM10 能够抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、扩散、迁移和侵袭[8]。然而，ADAM10 是否介导类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的研究鲜有报道。因此，本研究通过构建 ADAM10 特异性 siRNA，通过脂质体转染人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞 MH7A 细胞，观察沉默 ADAM10 基因对 MH7A 细胞凋亡及对炎症因子的影响，为揭示 RA 可能的机制及基因靶向治疗提供可能的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞 MH7A 细胞株购自日本 RIKEN 生物资源中心；DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司；胎牛血清、胰蛋白酶购自美国 Hyclone 公司；ADAM10 特异性siRNA 及ADAM10 非特异性siRNA 购自上海吉玛制药有限公司；Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂、Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司；M-MLV 逆转录试剂盒购自美国 Promega 公司；SYBR Primix Ex Taq 检测试剂盒购自日本 Takara 公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 细胞裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；ADAM10 兔抗人单抗购自美国 Cell Signal 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TNF-α、IL-6、IL-8 ELISA 检测试剂盒购自美国Bio-Techne 公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MH7A 细胞培养在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，置 37 ℃、体积分数为 5% CO2的细胞培养箱中进行孵育，根据细胞生长状态，每 2 天更换一次培养基，待细胞生长汇合率达 90% 时，使用胰蛋白酶消化传代培养。

1.2.2 细胞转染及分组 转染前 24 h 将处于对数生长期的MH7A 细胞接种于 6 孔板中，放置于 37 ℃培养箱中继续培养，当细胞生长汇合约 50% 时，根据Lipofectamine 2000 转染试剂说明书进行转染操作，使用的 siRNA 终浓度为 40 nmol/L，将转染ADAM10 特异性 siRNA 的 MH7A 细胞记为 ADAM10-siRNA 组，转染 ADAM10 非特异性 siRNA的 MH7A 细胞记为 NC-siRNA 组，未进行转染处理的 MH7A 细胞记为对照组。将转染后的各组细胞置 37 ℃培养箱中继续培养，48 h 后分别收集各组细胞及培养上清液。

1.2.3 qRT-PCR 检测 分别收集转染 48 h 后的各组MH7A 细胞，按照 Trizol 试剂说明书提取细胞中总 RNA，经蛋白核酸微量检测仪测定 RNA 浓度和纯度，选取260/280比值在 1.8 ~ 2.0 间的 RNA 进行逆转录，反应体系配置及反应程序设定均参照 M-MLV 逆转录试剂盒说明书进行，合成 cDNA。以 cDNA 为模板，采用 SYBR Primix Ex Taq 检测试剂盒进行定量检测，采用 20 μl 反应体系。反应采用 GAPDH 为内参，统计每孔 Ct 值，使用 2-ΔΔCt法分析各组细胞中ADAM10 mRNA 相对表达水平。引物：ADAM10 F：5' CTGCCCAGC ATCTGACCCTAA 3'，R：5' TTGCCATCAGAACTG GCACAC 3'；Bax F：5' GGGAGACACCTGAGCTG ACC 3'，R：5' GGACTCCAGCCACAAAGATGG 3'；Bcl-2 F：5' GAACTGGGGGAGGATTGTGGCC 3'，R：5' TCGACGTTTTGCCTGAAGACTGTTAA 3'；GAPDH F：5' ACCACAGTCCATGCCATCAC 3'，R：5' CCACCACCCTGTTGCTGTAG 3'。

1.2.4 Western blot 检测 转染 48 h 后收集各组 MH7A 细胞，加入 RIPA 细胞裂解液，于冰上提取细胞中总蛋白。以 BCA 蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，SDS 上样缓冲液与蛋白按比例混合，在沸水浴中加热 15 min 致蛋白变性，取 40 μg 蛋白样品加到上样孔中，行 SDS-PAGE 电泳，分离蛋白后以半干法转移至 PVDF 膜上，用 5% 脱脂奶粉进行封闭 2 h。加入1:1000 稀释的ADAM10 一抗，4 ℃过夜孵育。TBST 洗膜 15 min，洗涤3 次，加入1:3000 稀释的二抗，室温孵育 1 h。TBST 洗膜 15 min，洗涤3 次，加入 ECL 化学发光液显色，转移至暗室，曝光，以GAPDH 为内参，使用 Image J 图像分析软件统计分析，计算各组细胞中ADAM10 蛋白表达水平。

1.2.5 流式细胞仪检测 各组 MH7A 细胞转染48 h 后，以预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，离心收集细胞，加入 100 μl 结合缓冲液，重悬细胞，分别向细胞中加入Annexin V-FITC 和 PI 染液各5 μl，室温避光反应 30 min，再向细胞中加入 400 μl 结合缓冲液，上流式细胞仪检测，统计各组 MH7A 细胞凋亡率。

1.2.6 ELISA 检测 各组 MH7A 细胞转染 48 h 后，分别收集细胞培养上清液，根据 ELISA 检测试剂盒说明书测定上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 水平。使用酶标仪测定在 450 nm 波长处吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 转染 siRNA 对 MH7A 细胞中 ADAM10 表达的影响

qRT-PCR 和Western blot 检测结果见表 1 和图 1，ADAM10-siRNA 组 MH7A 细胞中 ADAM10 mRNA 和蛋白表达水平相比 NC-siRNA 组和对照组均明显下调（< 0.05）。NC-siRNA 组和对照组间 ADAM10 mRNA 和蛋白表达水平差异不显著（> 0.05）。提示在 MH7A 细胞中转染ADAM10-siRNA 能够有效沉默 ADAM10 基因及抑制 ADAM10 蛋白表达。

表 1 转染 48 h 后各组 MH7A 细胞中ADAM10 mRNA和蛋白水平比较（）

注：与对照组比，*< 0.05；与NC-siRNA 组比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

2.2 沉默 ADAM10 基因对 MH7A 细胞凋亡的影响

沉默 ADAM10 基因后采用流式细胞仪检测各组 MH7A 细胞凋亡情况，结果显示，ADAM10-siRNA 组细胞凋亡率相比NC-siRNA 组和对照组明显升高（< 0.05）。NC-siRNA 组和对照组间细胞凋亡率差异不明显（> 0.05），见表 2 和图 2。说明沉默 ADAM10 基因能够诱导 MH7A 细胞凋亡。

2.3 沉默 ADAM10 基因对 MH7A 细胞中 Bcl-2 和 Bax 蛋白表达的影响

采用qRT-PCR 检测各组 MH7A 细胞中凋亡相关基因 Bcl-2 和 Bax 表达水平，结果如表 3 所示，ADAM10-siRNA 组细胞中 Bcl-2 mRNA 表达水平相比 NC-siRNA 组和对照组明显下调（< 0.05），Bax mRNA 表达水平明显上调（< 0.05）。NC-siRNA 组和对照组间 Bcl-2 和 Bax 基因表达水平差异无统计学意义（> 0.05）。提示沉默 ADAM10 基因能够下调 Bcl-2 的表达，上调 Bax 的表达。

图 1 Western blot 检测各组 MH7A 细胞中 ADAM10 蛋白水平

Figure 1 Western blot analysis of ADAM10 protein levels in MH7A cells of each group

表 2 沉默 ADAM10 基因对 MH7A 细胞凋亡的影响（）

注：与对照组比，*< 0.05；与NC-siRNA 组比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

2.4 沉默 ADAM10 基因对 MH7A 细胞培养上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 含量的影响

采用ELISA 测定各组细胞培养上清液中TNF-α、IL-6 和 IL-8 含量，ADAM10-siRNA 组细胞上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 相比 NC-siRNA 组和对照组明显降低（< 0.05）。NC-siRNA 组和对照组间细胞上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 含量差异不明显（> 0.05），见表 4。提示沉默 ADAM10 基因能够抑制细胞分泌 TNF-α、IL-6 和 IL-8。

图 2 流式细胞仪检测各组 MH7A 细胞凋亡率

Figure 2 Flow cytometry to detect apoptosis rate of MH7A cells in each group

表 3 沉默 ADAM10 基因对 MH7A 细胞中 Bcl-2和 Bax 基因 mRNA 表达的影响（）

注：与对照组比，*< 0.05；与NC-siRNA 组比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

3 讨论

目前已有大量研究证实，RA 患者滑膜中的滑膜成纤维细胞不但存在过度增殖，还存在凋亡不足[9-10]。因此，有效诱导滑膜成纤维细胞的凋亡，也可能是治疗 RA 的方法之一。在 Isozaki 等[11]研究中，发现 ADAM10 在人 RA 滑膜成纤维细胞中的表达水平显著升高；后续研究发现 ADAM10 在 RA 患者的滑膜组织及滑液中均呈高表达，沉默 ADAM10 能够抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、扩散、迁移和侵袭，然而其是否能够影响滑膜成纤维细胞的凋亡尚未可知。ADAM10 在乳腺癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌等常见恶性肿瘤中亦呈高表达[12]。Zhang 等[13]研究，通过转染 siRNA 敲除肝癌细胞中 ADAM10 的表达，发现肝癌细胞凋亡增加。Fu 等[14]研究指出，ADAM10 可调节膀胱癌细胞增殖、侵袭、凋亡及化疗耐药。提示 ADAM10 可能参与细胞凋亡过程，因此，本实验通过在人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞 MH7A 细胞中转染 ADAM10 特异性 siRNA，有效降低了 MH7A 细胞中 ADAM10 表达的水平。经流式细胞仪检测发现，沉默 ADAM10 基因后，MH7A 细胞凋亡率显著升高。qRT-PCR 检测发现沉默 ADAM10 基因的 MH7A 细胞中 Bcl-2 mRNA 表达明显降低，而 Bax mRNA 表达明显升高。Bax 和Bcl-2 是细胞凋亡中研究最多、最透彻的基因，其中 Bax 是促凋亡基因，而 Bcl-2 是抑制细胞凋亡的基因[15]。本实验结果发现沉默 ADAM10 基因后 Bax 表达升高，Bcl-2 表达降低，提示沉默ADAM10 基因可能通过调节 Bcl-2、Bax 的表达水平进而使滑膜成纤维细胞凋亡增加。这与近期Guo 等[16]研究结果一致—— miR-152 通过靶向 ADAM10 抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖进而诱导细胞凋亡。

表 4 沉默 ADAM10 基因对 MH7A 细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-8含量的影响（）

注：与对照组比，*< 0.05；与NC-siRNA 组比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

众多研究发现，RA 患者滑膜成纤维细胞能够分泌包括 TNF-α、IL-6 和 IL-8 在内的多种炎症因子，炎症因子又可进一步促进滑膜成纤维母细胞的增生，两者均参与 RA 的发生与发展，TNF-α 是熟知的参与 RA 发病机制的关键炎症因子，使用 TNF-α 抑制剂治疗 RA 在临床上被证实是安全有效的[17]。此外，研究证实，IL-6 和 IL-8 在 RA 患者的血清和滑液中呈高浓度存在，在 RA 的发生发展中也起着关键作用，参与关节组织的破坏[18]。越来越多的证据表明 ADAM 家族参与炎症反应的调节，该家族的成员可以作为治疗炎性疾病（包括 RA）的新型治疗靶点[19]。因此，本研究设想，是否可以通过沉默 ADAM10 基因影响类风湿关节炎滑膜成纤维细胞炎症因子的分泌。结果显示 ADAM10 可调节人类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞分泌 TNF-α、IL-6 和 IL-8 等炎症因子。因此，ADAM10 有可能作为治疗RA 的新型治疗靶标。

综上，本实验证实了 siRNA 沉默 ADAM10 基因能够有效促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的凋亡，减少炎症因子释放，提示 ADAM10 可能作为 RA 基因治疗中的潜在作用靶点。

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Effect of ADAM10 gene silencing on apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis

WANG Pei, CHU Tian-shu, YAN Lei, LIU Bing, ZHU Qing, SHAO Feng-min

Department of Immunology and Rheumatology (WANG Pei, CHU Tian-shu), Department of Nephropathy (YAN Lei, LIU Bing, ZHU Qing, SHAO Feng-min), Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003, China

To investigate the effect of ADAM10 gene silencing on apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis.

ADAM10-specific siRNA was transfected into human rheumatoid arthritis synovial fibroblast MH7A cells. The experiment was divided into 3 groups: ADAM10-siRNA group, NC-siRNA group and control group, which were transfected with ADAM10-specific siRNA, ADAM10 non-specific siRNA or nothing, respectively. After 48 h of transfection, qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of ADAM10 in each group. Flow cytometry was used to detect apoptosis. The expression levels of apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax were detected by qRT-PCR. The levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 in the cell culture supernatant were determined by ELISA.

The expression of ADAM10 mRNA and protein in the ADAM10-siRNA group was significantly lower than that in NC-siRNA group and control group (< 0.05). After silencing the ADAM10 gene, the apoptosis rate of the ADAM10-siRNA group was significantly higher than that of the NC-siRNA group and the control group (< 0.05). The expression of Bax gene in ADAM10-siRNA group was significantly higher than that in NC-siRNA group and control group (< 0.05). The expression level of Bcl-2 gene was significantly lower than that in NC-siRNA group and control group (< 0.05). TNF-α, IL-6 and IL-8 secreted by ADAM10-siRNA group were significantly lower than those of NC-siRNA group and control group (< 0.05). Compared with the above indexes in the NC-siRNA group and the control group, the difference was not significant (> 0.05).

ADAM10 gene silencing can significantly promote the apoptosis of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and further reduce inflammatory factors such as TNF-α, IL-6 and IL-8, suggesting that silencing of ADAM10 gene makes it possible to reduce/control rheumatoid arthritis inflammation.

Arthritis, rheumatoid; Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts; ADAM10 gene; Apoptosis

SHAO Feng-min, Email: 250478232@qq.com

2017 年河南省医学科技攻关计划项目（201702180）

邵凤民，Email：250478232@qq.com

2018-12-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.006