八眉猪FABPs主要家族基因单核苷酸多态性筛查及生物信息学分析

张丽，农伟伦，卢建雄，张国华，刘丽霞

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730124）

八眉猪是我国优质的地方良种猪，主产区分布在青海互助、甘肃陇东、宁夏固原和陕西径河流域等地区，具有适应性好、抗逆性强、繁殖力高、耐寒、耐粗饲、肉味香美等特点，具有遗传性能稳定、近交不易衰退等特征[1]，是发展我国西北地区养猪业的重要品种资源，在未来的新品种（系）选育中仍然是不可或缺的种质资源。脂肪酸结合蛋白（fatty acidbinding protein,FABPs）属于细胞内脂肪结合蛋白超家族成员，是一类主要存在于哺乳动物细胞质中的小分子的可溶性蛋白质。由于长链脂肪酸能够与FABPs空间结构上具有高亲和力的结合位点以非共价键的形式特异性结合，将脂肪酸转运到线粒体、内质网及细胞核，从而有效地促进酯化反应，合成三酰甘油，参与脂类代谢等[2]。至今已分离鉴定出12种不同结构类型的脂肪酸结合蛋白[3]，其中肝脏型脂肪酸结合蛋白基因（FABP1，又称L-FABP）、肠型脂肪酸结合蛋白基因（FABP2，又称I-FABP）、心脏型脂肪酸结合蛋白基因（FABP3，又称H-FABP）、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因（FABP4，又称AFABP）是该家族中最主要的4种蛋白基因[4]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）是染色体基因组中单个核苷酸碱基以转换和颠换形式突变引起的DNA序列的变化，是基因组水平上最常见的一种遗传变异类型[5]。部分位于基因内部编码区的SNPs可能引起蛋白质编码氨基酸序列的改变，这种变异会影响基因组DNA各组成元件的功能、转录产生的mRNA水平及蛋白质的表达，进一步会导致生物体性状或功能的改变。

脂肪酸结合蛋白基因是影响肌内脂肪（intramuscular fat,IMF）含量的重要基因，脂肪酸结合蛋白基因多态性可以通过调控脂肪代谢来改善畜产品品质，提高饲料利用率，降低环境污染。陈桂莲[6]研究发现，丹育黑猪、辽宁黑猪、冀合白A系、冀合白B系、长白猪、大白猪和杜洛克猪FABP1基因均存在相同的7个SNPs位点，并且每个位点各品种的基因型分布及其频率都有差异，其中TTAACC基因型的IMF最高；刘智[7]研究显示，杜长大商品猪FABP2基因启动子区存在5个完全连锁的SNPs位点，主要有CGTTA和TACCG 2种单倍型，对启动子活性分析表明，CGTTA单倍型荧光活性显著高于TACCG单倍型（P＜0.01），但CGTTA纯合基因型肌内脂肪含量显著低于TACCG纯合基因型（P＜0.01）；周春宝等[8]研究表明，苏姜猪FABP3基因5´UTR区和第2内含子多态性对其肉质性状有显著影响；朱爱文等[9]研究发现，FABP4基因第1内含子遗传多态性对猪肌内脂肪含量和大理石花纹影响显著。由此推断，FABPs主要家族基因可能是影响猪IMF的主效基因或是与主效基因紧密连锁的标记基因。

鉴于此，本研究选用青海八眉猪为研究对象，利用DNA池与直接测序技术对八眉猪脂肪酸结合蛋白主要家族基因FABP1、FABP2、FABP3、FABP4的外显子序列进行SNPs检测，并进行生物信息学分析，为研究其基因对脂肪沉积的影响奠定基础，同时为八眉猪的选种与保种工作提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 基因组总DNA提取及DNA池构建

八眉猪耳组织样采自青海省互助县八眉猪保种场。选择222头哺乳期仔猪为采样对象，于仔猪出生1周后采集耳组织，采样前对每头仔猪耳朵用75%乙醇消毒，剪取耳组织约4 g，置于装有75%乙醇的离心管中，低温环境下带回实验室，于－40℃冰箱中保存，备用。采用传统苯酚-氯仿抽提法提取八眉猪耳组织总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，用紫外分光光度计检验每个样品DNA质量浓度，加蒸馏水调整样品DNA质量浓度至100 ng/µL，每45个DNA构建1个总DNA池。

1.2 引物设计

从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）数据库中获得猪FABP1、FABP2、FABP3、FABP4基因DNA序列（GenBank登录号分别为DQ182323、EU189034、HM591296、EF061481），利用 Primer-BLAST针对每个基因的4个外显子分别设计1对特异性引物，共16对，引物信息见表1。

表1 八眉猪FABPs主要家族基因引物信息Table 1 Informations for primers of FABPs genes in Bamei pig

1.3 DNA扩增与序列测定

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增分别得到八眉猪FABP1、FABP2、FABP3、FABP4基因的4个外显子序列。PCR反应体系为20µL：2×TaqPCR Master Mix 10 µL，上、下游引物各1µL，基因组DNA2µL，双蒸水6µL。PCR扩增步骤：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s；退火30 s，各引物退火温度参见表1；72℃延伸30 s；35个循环后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增的PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过凝胶成像仪拍照并记录结果。检验良好的PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收后直接送至苏州金唯智生物有限公司进行正反双向测序，测序结果用Lasergene 7.0软件比对、矫正，最终获得八眉猪FABPs主要家族基因序列，结合BLAST分析确定SNPs位点。

1.4 等位基因频率的估算

利用BioEdit软件查看测序结果，并运用MWSnap软件对各SNPs等位基因峰高进行测量，依据公式对各等位基因的频率进行估算[10]。其中，fi表示某SNPs位点某个等位基因频率，l1和l2分别表示测序图上该SNPs位点2个等位基因的峰高度。

1.5 突变前后多态位点生物信息学分析

对八眉猪FABPs主要家族基因编码区生物信息学分析按照文献[11-12]介绍的在线软件进行。

2 结果与分析

2.1 八眉猪FABPs主要家族基因PCR扩增及序列测定

八眉猪耳组织DNA经琼脂糖凝胶电泳检测，条带明亮整齐。经紫外分光光度计检测，D260/D280比值在1.6～1.8范围内，表明八眉猪耳组织总DNA提取效果较好，可用于PCR扩增。分别取5µLFABP1、FABP2、FABP3、FABP4基因4个外显子的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段与目的片段大小吻合，条带清晰、无杂带，表明扩增引物特异性较好。

对八眉猪FABPs基因测序结果进行比对，共筛查出15个SNPs位点（图1），其中FABP1基因存在7个SNPs位点：以第1外显子为基准，在第1外显子57 bp处发生A→G突变，在第2外显子2 006 bp处发生T→C突变，在第2外显子2 011 bp处发生A→C突变，在第2外显子2 033 bp处发生C→A突变，在第3外显子3 751 bp处发生G→A突变，在第3内含子3 943 bp、4 303 bp处分别发生T→A、T→C突变，分别将其命名为A57G-Exon1-FABP1、T2006CExon2-FABP1、A2011C-Exon2-FABP1、C2033A-Exon2-FABP1、G3751A-Exon3-FABP1、T3943A-Intron3-FABP1、T4303C-Intron3-FABP1。其中 C2033A-Exon2-FABP1、G3751A-Exon3-FABP1为错义突变，分别导致氨基酸由原来的亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）被替换为甲硫氨酸（Met）和丝氨酸（Ser），分别命名为L74M、G87S。FABP2基因5´侧翼区－207 bp处发生A→T突变，将其命名为A－207T-5´UTR-FABP2。FABP3基因5´侧翼区－332 bp处发生G→A突变，第1内含子807 bp处发生C→T突变，第3外显子3 073 bp处发生C→T突变 ，分别命名为 G－332C-5´UTR-FABP3、C807TIntron1-FABP3、C3073T-Exon3-FABP3。FABP4基因第1内含子109 bp处发生G→C突变；3´侧翼区4 474bp处发生A→G突变，4 487 bp处发生T→A突变，4 536 bp处发生C→T突变，分别命名为G109C-Intron1-FABP4、A4474G-3´UTR-FABP4、T4487A-3´UTR-FABP4、C4536T-3´UTR-FABP4。

图1 八眉猪FABPs主要家族基因的扩增测序及BLAST分析结果Fig.1 Results of sequencing of the main family genes for FABPs and BLAST analysis in Bamei pig

2.2 SNPs等位基因频率估算

利用MWSnap软件标尺分别测量FABP1、FABP2、FABP3、FABP4基因的各SNPs等位基因峰高，根据公式估算SNPs等位基因频率。从表2中可以看出，除了G3751A-Exon3-FABP1位点突变前后等位基因频率差异较小外，其余SNPs的等位基因频率在突变前后均有明显差异。

表2 八眉猪FABPs主要家族基因的SNPs位点突变类型及等位基因频率估算Table 2 SNPs locus mutation types and estimation of allele frequency of FABPs gene in Bamei pig

2.3 mRNA二级结构分析

对引起错义突变的C2033A-Exon2-FABP1、G3751A-Exon3-FABP1位点进行mRNA二级结构预测，结果显示，SNPs位点突变前后引起mRNA二级结构改变，mRNA二级结构自由能也发生变化（图2）。其中：C2033A-Exon2-FABP1位点突变前后的自由能由－451.45 kJ/mol变为－449.78 kJ/mol；G3751AExon3-FABP1位点突变前后的自由能由－451.45 kJ/mol变为－440.16 kJ/mol。

图2 mRNA二级结构变化结果Fig.2 Results of secondary structure change of mRNA

2.4 蛋白质二级结构分析

分别对八眉猪FABP1基因突变位点C2033AExon2-FABP1、G3751A-Exon3-FABP1进行蛋白质二级结构分析，结果表明：C2033A-Exon2-FABP1位点突变前后的α-螺旋和无规则卷曲均有所改变；G3751A-Exon3-FABP1位点突变前后的α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和扩展链均无变化（表3）。

2.5 蛋白质突变前后三级结构分析

为了解蛋白质结构及其相关功能，本研究对C2033A-Exon2-FABP1、G3751A-Exon3-FABP1位点突变前后蛋白质三级结构进行预测分析，结果表明，C2033A-Exon2-FABP1位点碱基由C→A、对应氨基酸由亮氨酸（Leu）→甲硫氨酸（Met）时，G3751AExon3-FABP1位点碱基由G→A、对应氨基酸由甘氨酸（Gly）→丝氨酸（Ser）时，其蛋白质三维结构突变前后均没有改变（图3）。

3 讨论

肌内脂肪含量是影响猪肉品质的主要指标，其与肉质嫩度、系水力、多汁性及风味有很强的相关性。优质猪肉的IMF是2%～3%，若IMF低于2%时，肉的品质和口感均较差[13]。苏玉虹等[14]研究证实，适当提高IMF会持续有效地改善猪肉品质，因而提高猪肉IMF也是近年来畜禽肉质领域研究的热点。HOVENIER等[15]研究发现，猪的IMF具有较高的遗传力（0.6），且IMF与背膘厚的遗传之间是中等偏低的不利相关（0.3），因此对猪IMF的遗传改良是切实可行的。但是活体测定IMF存在一定难度，故可利用DNA标记辅助选择（marker assisted selection,MAS）来寻找控制IMF的基因并对其进行遗传选育，以提高IMF含量，从而改善猪肉品质。JANSS等[16]的主基因效应分析表明，猪上存在1个与IMF沉积有关的主效基因，但有关这一主效基因的位置和作用方式却不清楚。因此，寻找与IMF沉积有关的主效基因将成为家畜育种工作者新的研究热点。脂肪酸结合蛋白家族基因（FABPs）是调控动物脂肪代谢的重要基因，该基因的多态性筛选也成为分子改良家畜肉质性状的研究热点，尤其是FABP3和FABP4基因作为影响IMF的候选基因而被广泛研究，其表达量与IMF呈正相关[17]。FABPs家族所有成员都具有管理脂肪酸吸收和细胞内转运的最基本功能，由于长链脂肪酸能够与FABPs空间结构上具有高亲和力的结合位点以非共价键的形式紧密结合在一起，所以能够将其转运到线粒体发挥氧化功能，转运到内质网合成三酰甘油，转运到细胞核参与核受体基因介导的调控作用[18]。FABPs家族基因是影响肌内脂肪含量的重要候选基因，深入研究该家族基因的蛋白结构与功能，可为八眉猪肌内脂肪沉积的分子机制研究提供理论基础。将该基因的优势基因型作为后代品种选育的参考依据，可提高八眉猪生产性能，改善肉质，并能更好地满足消费者的要求。

表3 蛋白质突变前后二级结构预测分析Table 3 Analysis of prediction of secondary protein structure with different mutations

图3 蛋白质三级结构变化结果Fig.3 Results of tertiary structure change of protein

单核苷酸多态性（SNPs）位点具有高度多态性和高遗传稳定性等优点，可最大限度地代表不同个体之间的遗传差异，在哺乳动物基因中平均每300～1 000 bp就有1个SNPs[19]位点。单核苷酸多态性分为2种形式：一种是遍布于基因组的大量单碱基变异，另一种是基因编码区的功能性突变。后者又称为错义突变，可引起表达蛋白的多态性变异，有时也会影响它们的功能特性。一旦单核苷酸多态性达到DNA分子多态性的极限，便可以提供大量的信息进行基因连锁不平衡分析，获得群体的遗传多样性、起源、迁移及遗传漂变等信息，从而厘清群体的进化过程。为了寻找更多的基因多态性，丰富遗传标记，本研究利用DNA池和直接测序法对青海八眉猪FABP1、FABP2、FABP3、FABP4基因进行SNPs检测，共筛查出15个SNPs位点，其中T3943AIntron3-FABP1、T4303C-Intron3-FABP1、C807T-Intron1-FABP3、G109C-Intron1-FABP4分别在FABP1、FABP3和FABP4基因内含子。T3943A-Intron3-FABP1突变在梁艳[20]的研究中也被检测到，且该位点形成的3种基因型对IMF影响不显著（P＞0.05），与眼肌面积和背膘厚显著相关（P＜0.05）。其他3个突变仅在被检测的八眉猪种中发现，是否在其他地方的猪种和国外猪种中也存在，还需要进一步试验探寻。虽然内含子没有编码功能，但近年来不断有研究证实内含子可以调节基因mRNA的加工、出核和翻译；在某些基因的内含子中发现了增强基因表达元件，可见基因内含子可能调控基因表达，内含子的某些碱基突变可能与遗传性状有关。研究者陆续对中国地方畜禽品种进行了FABPs基因多态性与肉质性状的相关分析。刘利刚等[21]利用聚合酶链式反应-单链构象多态性（polymerase chain reaction-singlestrand conformation polymorphism,PCR-SSCP）方法发现，松辽黑猪FABP1基因第1内含子C276A的错义突变形成AA、BB、AB 3种基因型，其中AA、AB基因型的IMF极显著高于BB基因型，AA型大理石纹显著明显于AB、BB型，BB型滴水损失率显著高于AA、AB型。徐松松等[22]研究发现，东北农业大学F2鸡资源群体FABP2基因第1、2内含子内存在A601T、C1018T和G3267A 3个SNPs位点，它们与鸡的生长和屠体性状显著相关，影响鸡体质量和骨骼性状的数量性状基因座（quantitative trait locus,QTL）可能位于这3个SNPs位点构建的单倍型区域内。GERBENS等[23]首先发现，杜洛克猪FABP3基因在5´调控区和第2内含子上存在3个遗传变异位点，且纯合单倍体aa-dd-HH与高IMF有关，MspⅠ和HaeⅢ位点对背膘厚也有极明显的作用。朱淑斌等[24]研究表明，姜曲海猪FABP4基因第1内含子区域存在BsmⅠ酶切多态性，形成的基因型对姜曲海猪猪肉的大理石纹和肌内脂肪含量均有显著影响（P＜0.05），AA、AB型大理石纹均显著明显于BB型（P＜0.05），AA型肌内脂肪含量显著高于AB、BB型（P＜0.05），这与张金耀等[25]对莆田黑猪的研究结果一致。

八眉猪FABPs基因非翻译区存在A－207T-5´UTRFABP2、G－332C-5´UTR-FABP3、A4474G-3´UTR-FABP4、T4487A-3´UTR-FABP4、C4536T-3´UTR-FABP4，此5个SNPs突变位点未见盘道兴等[12]在江口萝卜猪上报道。在真核生物中，虽然5´和3´调控区在长度上有差异，但5´调控区的长度在演化过程中比3´调控区显得更保守[26]。5´调控区包含基因的转录起始位点、启动子序列及多种转录调控因子的结合位点，其DNA序列多样性显著影响基因表达水平和表达产物的多样性，其变异可能对基因的启动子活性和表达强度等都产生影响，从而影响其下游调控基因的表达水平，进而发挥对生长发育的调控作用[27]。真核生物mRNA的3´调控区不仅能调控mRNA的稳定性、控制mRNA的亚细胞定位，而且还能指导特定氨基酸的编码过程[28]。一些真核生物mRNA的3´调控区的碱基突变既可以引发疾病，又可以抑制肿瘤的生长。大量报道证实，FABP1和FABP2基因多态性与脂类代谢相关[29-30]，关于FABP1和FABP2基因的研究主要集中在人类脂质代谢病上，而与畜禽肉质性状的关联研究极少，初丽丽等[31]利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RLFP）技术研究发现，鸡FABP2基因5´侧翼区的G－822A突变位点AA基因型个体的5～7周龄体质量和屠体质量显著高于AG、GG基因型个体（P＜0.05），并首次推测FABP2基因可能是影响鸡体质量的主效基因或与影响该性状的主效基因紧密连锁。针对FABPs基因对各地方猪种IMF的影响，张越等[32]利用DNA池和PCR-RFLP技术对安徽地方猪FABP3基因检测发现，5´调控区存在1个SNPs位点，它与肉质性状的粗蛋白质、总脂肪、游离脂肪和16种氨基酸含量表型值间均未达显著相关水平（P＞0.05），第2外显子存在1处SNPs位点，仅与谷氨酸含量显著关联（P＜0.05）。高妍等[33]研究认为，FABP4基因5´调控区多态性对松辽黑猪和军牧1号白猪肉质性状有较大影响，并指出B等位基因是影响松辽黑猪和军牧1号白猪IMF和大理石纹的优势等位基因，提高该等位基因在5´调控区的含量，可能会提高松辽黑猪和军牧1号白猪的大理石纹和IMF含量。这些差异可能是不同猪种具有不同肉质的主要原因之一。

外显子区的A57G-Exon1-FABP1、T2006C-Exon2-FABP1、A2011C-Exon2-FABP1、C3073T-Exon3-FABP3多态位点为同义突变，均未能引起对应氨基酸的改变；在FABP1基因外显子上的C2033A-Exon2-FABP1和G3751A-Exon3-FABP1多态位点经序列比对后发现是错义突变，分别导致氨基酸由原来的亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）替换为甲硫氨酸（Met）和丝氨酸（Ser）。八眉猪FABP1基因外显子2上的T2006CExon2-FABP1、A2011C-Exon2-FABP1、C2033A-Exon2-FABP1突变与盘道兴等[12]、陈桂莲[6]的报道一致，区别在于盘道兴等[12]认为C2033A-Exon2-FABP1错义突变将氨基酸由谷氨酸（Glu）替换为丙氨酸（Ala）。另外，陈桂莲[6]在辽宁黑猪、丹育黑猪等群体中还发现存在C1755T、T1870C、A1875C、C1897A 4个SNPs位点，其中C1755T突变形成的CC基因型的IMF显著高于CT、TT基因型；T1870C、A1875C 和 C1897A3个位点表现出连锁关系，基因型之间IMF差异不显著（P＞0.05），有3个位点存在的TT-AA-CC基因型IMF值较高。八眉猪FABP2和FABP4基因4个外显子区域均未检测出多态性，这与于小燕[34]在松辽黑猪FABP4基因外显子区未发现多态位点的结果一致。而盘道兴等[12]研究表明，江口萝卜猪FABP2基因外显子2存在1个A65T-Exon2-FABP2的错义突变，氨基酸由赖氨酸（Lys）替换为甲硫氨酸（Met），外显子4无多态位点；张越等[32]在圩猪和皖南花猪等群体中也检测到与江口萝卜猪相同的错义突变位点，氨基酸由异亮氨酸替换为苏氨酸，氨基酸序列变化存在明显差异。八眉猪FABP3基因外显子3上存在1个C3073T-Exon3-FABP3的同义突变，外显子4上无多态位点，而江口萝卜猪群体中存在1个G40AExon4-FABP3的错义突变，氨基酸由谷氨酸（Glu）替换为赖氨酸（Lys）。FABP1作为影响IMF的候选基因，C2033A-Exon2-FABP1和 G3751A-Exon3-FABP1错义突变对八眉猪肌内脂肪含量或肉质性状影响的研究，国内尚未见报道。相关研究报道有，JIANG等[35]研究了猪FABP1基因外显子2内的C1745T多态位点，结果表明等位基因C具有提高肌内脂肪含量的遗传效应。廖秀冬等[36]利用直接测序法和PCRRFLP技术发现，北京鸭FABP2基因存在4个SNPs位点，其中第3外显子T92C的错义突变与北京鸭的部分体尺和屠体性状显著相关，可作为北京鸭体尺和屠体性状标记辅助选择的分子标记。针对猪FABP3和FABP4基因多态性多采用PCR-RFLP方法，关于其与肌内脂肪含量的相关研究仅集中在5´UTR和内含子1区域内。表现出品种间的差异性，可能是环境、遗传、营养和饲养管理的不同，这需要进一步设计周密的试验，继续分析影响该性状的因素。今后，需继续研究FABPs基因的不同区域，寻找更多的多态位点，并扩大群体规模，联合更多相关的侯选基因或DNA标记来进行分析，寻求与IMF沉积紧密连锁的遗传标记，以便在动物育种实践的标记辅助选择（MAS）中发挥遗传改良作用。

对引起错义突变的C2033A-Exon2-FABP1和G3751A-Exon3-FABP12个多态位点分别进行突变前后的生物信息学分析表明，G3751A-Exon3-FABP1位点等位基因频率在突变前后变化最小，C2033AExon2-FABP1位点等位基因频率在突变前后有明显差异；mRNA二级结构分析结果显示，突变前后mRNA二级结构发生改变，导致其自由能发生改变，与江口萝卜猪的一致。mRNA二级结构和自由能的改变均会影响其结构的稳定性，进而可能会影响后续蛋白质翻译过程及其相关功能的表达。蛋白质二、三级结构分析结果表明：C2033A-Exon2-FABP1位点突变前后二级结构的α-螺旋（21.26%→20.47%）和无规则卷曲（24.41%→25.20%）所占比例有较小改变；其余蛋白质二、三级结构突变前后均没有改变。盘道兴等[12]研究认为，C2033A-Exon2-FABP1位点突变前后的α-螺旋、β-转角和扩展链有所改变，而无规则卷曲不变。以上研究结果表明，八眉猪FABPs主要家族基因SNPs位点可能通过影响编码氨基酸序列，从而影响相关蛋白质的二、三级结构，进而影响蛋白质对应的相关调控功能。

肌内脂肪含量的提高能够更好地改善猪肉的感观品质和食用品质，因此，提高肌内脂肪含量已成为现代畜牧业，尤其是家畜遗传育种领域的研究热点。在此基础上，探究脂肪酸结合蛋白主要家族基因单核苷酸多态位点与八眉猪肌内脂肪含量是否相关，并研究其相应的分子机制具有重大意义，为阐明FABPs主要家族基因FABP1、FABP2、FABP3、FABP4在八眉猪体内脂肪沉积代谢过程中的调控机制奠定分子理论基础。

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