ctDNA检测在结直肠癌临床诊疗中的应用进展

谢英超 周春莲 徐伟文

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的消化道肿瘤之一，据2018年全国最新癌症报告显示，CRC发病率、病死率在恶性肿瘤中均位居前5位且保持上升趋势[1]。CRC起病隐匿，早期病变位于黏膜层及黏膜下层，且病情发展缓慢，直至中晚期才会出现明显临床症状[2]。其发生发展是一个多因素、多基因、多过程综合作用的结果，既有多种基因突变、缺失和杂合子丢失，又涉及表观遗传学改变如基因的甲基化以及组蛋白的修饰。当前CRC临床诊疗难点主要在于以下几个方面：①CRC在早期很难被及时发现；②组织活检有创，具有肿瘤异质性且反复获取不实际；③常规肿瘤标志物存在灵敏度低、特异性差等缺点；④不能随时对诊疗效果进行监测评估；⑤肿瘤的异质性使得对个体化用药的指导以及耐药性监测手段受限等。早诊断早治疗、实时监控、靶向用药以及个体化治疗是提高肿瘤远期生存率、降低死亡率的关键，而无法准确捕捉具有时空特异性的肿瘤是当前癌症临床诊疗面临的最大难题，循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测被公认为是目前解决此问题的最佳方案。ctDNA作为液体活检的生物标志物之一，具有较高的特异性，相较于传统诊断手段，ctDNA检测表现出诸多优势：①无创，实时，多次；②能够反映肿瘤基因组信息；③假阳性率低，灵敏度高，准确度高；④能够对肿瘤的演化和适应性改变进行监控；⑤能够对肿瘤病人的治疗效果进行实时监控（尤其在追踪肿瘤转归、转移、复发等方面），为个性化治疗提供指导（如个性化靶向用药、个性化治疗等）。本文对比了常见的ctDNA检测技术并就ctDNA检测在结直肠癌早期诊断与筛查、疗效判断与预后评估、耐药监测与用药指导等方面的应用进展进行了综述，阐释了该技术的临床应用科学性及优势、发展前景以及面临的挑战，以期对CRC患者的临床诊疗认知有所裨益。

1 ctDNA的生物学特性

1948 年，Mandel和 Metais[3]首次发现人体血液中存在着游离DNA。1965年，Bendich团队[4]发现肿瘤与循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）存在相关性。1977年，Leon等[5]通过对比正常人，发现肿瘤患者血中游离DNA浓度更高且与肿瘤病程及疗效相关。cfDNA是由正常细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞等凋亡、坏死后释放到血管中的游离DNA，通常与蛋白质结合形成核小体游离于循环中[6]，大小集中在166 bp左右[7]，片段之间差异较大。来源于肿瘤的这部分cfDNA，称之为ctDNA。

ctDNA占cfDNA的比例可以低至0.01%，也可高达90%甚至以上，半衰期较短，从15 min到几个小时不等，并被肾脏、肝脏和脾脏迅速清除[8]。ctDNA的遗传信息与肿瘤保持着高度一致性，故可以通过分析ctDNA的基因变异类型与数量来确定治疗手段或靶向药物。此外，ctDNA含量在不同类型肿瘤中、同类型肿瘤不同个体中以及同类型肿瘤不同分期中均存在差异。Bettegowda等人[9]通过评估16种不同组织类型的187种肿瘤的ctDNA，证明了不同的肿瘤类型ctDNA检出率不同；基因拷贝数不同可能导致同类型肿瘤患者的ctDNA浓度不同；ctDNA检出率的差异也与分期有关：47%的Ⅰ期癌症患者有ctDNA可检出，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌的ctDNA检出率分别为55%、69%和82%。Yang等[10]报道了结直肠癌IV期患者的ctDNA浓度显着高于I期患者且ctDNA浓度增加与肿瘤大小增加相关，高浓度ctDNA的存在往往预示着癌症晚期及不良预后。

2 ctDNA检测技术

目前ctDNA检测技术并不完善，理论上来说，所有能检测基因组信息的手段都可以检测ctDNA，由于癌症患者血液中肿瘤ctDNA的水平极其低，因此需要寻求高灵敏度和高特异性的检测技术。以Sanger测序法为代表的一代测序技术敏感性很低，下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）则大大提高了ctDNA检测的技术水准，其通过反复测序同一区域的DNA片段以此提高灵敏度和准确度，其通量高、自动化程度高，可在短时间内完成上百亿碱基的测序。正在发展的“第三代”全基因组测序技术虽成本昂贵，但在癌症患者个性化管理中有着极大的应用前景。目前，对于已知致癌突变位点的检测，一般采用数字聚合酶链式反应（digital PCR，dPCR）、磁珠乳液扩增技术（beads，emulsion，amplification，and magnetics，BEAMing）、基于PCR的突变扩增系统（amplification refractory mutation system PCR，ARMs-PCR）、双向焦磷酸解激活的聚合反应（bidirectional pyrophosphorolysis-activated polymerization，Bi-PAP）、标记扩增深度测序（tagged-amplicon deep sequencing，TAM-Seq）以及基于深度测序的肿瘤个体化指纹图谱（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）；而对于未知致癌突变位点的检测，则可采用全基因组测序、外显子测序、RNA末端平行分析法以及全基因组甲基化测序。常见的ctDNA检测技术比较见表1。

3 ctDNA在结直肠癌诊疗中的应用

3.1 早期诊断与筛查

CRC早期很难发现，多数患者初诊时就已处于中晚期阶段，这极大增加了CRC治疗难度，严重影响了患者的治疗，而恶性肿瘤诊疗的关键就在于早期发现、早期治疗。CRC患者在早期（Ⅰ期、Ⅱ期）进行治疗，5年存活率为75%～90%；对于晚期（Ⅲ期、Ⅳ期）患者，5年存活率仅为40%～55%和10%[15]。如何提高CRC的早期诊筛率成为近年来CRC领域的研究热点，以往多项研究均阐释了ctDNA检测在CRC早期诊断和筛查方面具有重要的指导意义。Yang等[10]研究验证了ctDNA的检出率高于目前5种已知的常用肿瘤生物标志物（癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、糖类抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、癌抗原 125（cancer antigen 125，CA 125）、癌抗原72-4（cancer antigen 72-4，CA72-4）），对几乎所有癌症分期患者的检出率均高于最低检出限。Frattini等[16]研究发现CRC患者血浆DNA水平显著升高，而治愈后DNA水平下降，再复发时再次升高。Symonds等[17]在对91名CRC患者手术前后血液样本的分析中发现，47例患者在诊断时具有ctDNA阳性，35例（74.5%）在肿瘤切除后变为阴性。血液中ctDNA的存在与CRC分期相关，并且在手术切除后显示快速逆转为阴性。以往多项研究也都报道了CRC患者ctDNA水平比健康人明显升高[18-20]。液体活检中另一重要的生物标志物循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）和ctDNA有着许多同样的优势，如非侵入式、特异性高以及一定程度上克服肿瘤时间和空间异质性等，但ctDNA灵敏度更高，Bettegowda等[9]发现能够检出CTC的就一定会检出ctDNA，但检出ctDNA的却未必能找到CTC。由此可见，ctDNA是一种相对较好的疾病指标。此外，有研究在检测中联合使用了ctDNA与CEA，发现只使用ctDNA检测CRC的特异性为70.7%，而CEA及ctDNA均为阳性使特异性可达100%[21]。这提示了我们在临床上可将ctDNA与CEA相结合，从而提高特异性。

表1 常见的ctDNA检测技术比较[11-14]Table 1 Comparison of common technology for ctDNA detection[11-14]

3.2 疗效判断

肿瘤的疗效判断是非常重要的，可以避免无效的治疗、减少毒副反应以及更换新的疗法。晚期CRC一般都是不能治愈的，若是能够寻找早期、特异的指标检测微小转移灶，有效地预测复发转移风险，这样就能通过治疗提早干预临床转移灶的出现，又能避免部分术后治愈的患者接受过度的辅助治疗。多项研究表明定性定量检测ctDNA水平变化可用于CRC患者的病情监测、治疗效果反馈、残留微小病灶判断及高危复发者识别等。Diehl等[22]研究发现ctDNA在所有患者术前均能检测到，而连续血液取样显示ctDNA水平与手术切除程度有关。Cheng等[23]报道了ctDNA既可以用来判断肿瘤是否切除干净，又可以判断药物治疗是否有效。在转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）患者治疗期间，治疗开始后，ctDNA水平立即急剧下降，手术后检测不到，复发时ctDNA水平再次升高。Hsu等[24]使用12基因面板对32例mCRC患者的136个肿瘤组织和ctDNA样本进行了NGS，约70%的标本中检测到遗传变异，肿瘤组织与血浆ctDNA的一致性较高（85%），随访了18例患者发现ctDNA水平的变化与肿瘤缩小密切相关。Song等[25]研究表明尿液中ctDNA水平升高与mCRC患者相关（敏感性：90.7%；特异性：82.0%），对于接受化疗或抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制剂治疗的患者，ctDNA量反映了早期治疗反应，连续监测ctDNA水平可以对治疗反应进行早期预测，并有效识别高危复发患者。Murray等[26]在CRC患者手术后12个月内测定甲基化BCAT1和IKZF1的ctDNA状态，发现甲基化ctDNA阳性的CRC病例残留疾病和随后复发的风险大大增加。Diehl等[22]发现mCRC患者手术切除后微小病灶的残留与ctDNA水平较高有关，监测术后血浆中肿瘤特异基因APC、TP53和KRAS的突变情况来判断肿瘤复发，灵敏度和特异性几乎均达到100%。Wang等[27]研究发现ctDNA检测与术后复发有显著相关性（P＜0.001）。Scholer等[28]报道了复发患者的术后ctDNA均可被检测到，未复发患者中检测不到。与CT成像相比，ctDNA检测到复发平均提前9.4个月，复发干预引起的ctDNA水平变化与肿瘤体积的变化具有良好的一致性，这也充分体现了ctDNA作为一种肿瘤特异性的生物标志物，在监测病情和早期复发上具有明显的优势。该研究还表明了术后ctDNA检测可以提供残余病灶的证据，并能识别出复发风险非常高的患者。

3.3 预后评估

CRC患者经治疗后，在适当的条件下仍能进一步发展成新的肿瘤灶。肿瘤患者的预后评估需要结合临床观察、肿瘤分期、病理和生物分子特征等判断，目前主要依赖影像学和组织活检，当遇到无法进行组织活检或已保存的组织切片基因分析时，液体活检就显得愈加重要。多项研究均报道了ctDNA可以用来评估手术及化疗后的预后。Thomsen等[29]在对138名接受标准一线治疗的mCRC患者的研究中发现，第一轮化疗后低水平的ctDNA与进展风险低有关，在治疗过程中任何时间ctDNA的显著增加都预示着持续治疗的高风险。Yao等[30]报道了RAS/BRAF突变的ctDNA检测可预测mCRC一线化疗患者无进展生存期（progression-free survival，PFS）的恶化，为RAS/BRAFctDNA突变检测在mCRC患者中的预后价值提供支持。Vandeputte等[31]监测患者ctDNA水平时发现其与PFS和整体存活率（overall survival，OS）呈负相关。Tie等[32]分析了来自159例患者的462份血浆样本，在治疗前、放射治疗后和术后血浆样本中，ctDNA分别为77%、8.3%和12%。术后ctDNA检测均可预测复发，若化放疗后或术后可检测到ctDNA，则无复发生存率明显更差。对于术后ctDNA阳性或阴性患者，估计3年无复发生存率分别为33%、87%。Zhou等[33]报道了一例患者疾病复发时，ctDNA增加了13倍，而CEA和CA 19-9水平保持正常。Young等[34]发现ctDNA监测CRC复发比CEA敏感2倍。这些都体现了ctDNA对预测CRC患者的预后具有高度敏感性和特异性。

3.4 耐药监测与用药指导

肿瘤耐药是当前CRC临床治疗面临的最主要的问题之一，其耐药机制十分复杂，利用ctDNA检测可以非侵入性地了解耐药突变的产生和寻找新的治疗靶点且方便可行，有望推动CRC靶向治疗的进程。EGFR抑制剂是当前CRC治疗的主要靶向药物之一，EGFR在60%～80%CRC中过度表达，以EGFR为靶点的单克隆抗体阻断EGFR的信号传导可以抑制肿瘤新生血管的形成、肿瘤生长、侵袭和迁移。CRC对EGFR抑制剂总是产生耐药性，RAS突变和HER2/MET扩增是最常见的耐药机制[35]。Bettegowda等[9]对KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA和EGFR全外显子进行检测，发现96%的样本的KRAS或NRAS基因有至少一个突变。Diaz等[36]利用ctDNA检测技术对接受EGFR抑制剂类药物治疗的患者进行耐药性靶点检测，发现KRAS基因出现了42种与耐药相关的基因突变，从而可以追踪耐药突变的产生，达到定性并定量。Misale等[37]报道了野生型KRAS的mCRC患者在EGFR抑制剂治疗进展后血浆中能检测到KRAS突变，KRAS水平呈进行性增加，中断EGFR抑制剂后KRAS突变呈进行性下降。Arena等[38]使用抗EGFR类抗体如西妥昔单抗和帕尼单抗治疗RAS野生型CRC时发现其疗效受到获得性耐药的限制。于是他们假设EGFR抗ECD（EGFR胞外区域）变异体可能是寡克隆抗体MM-151（该抗体可与ECD多个位点结合后，抑制EGFR信号传导和细胞生长）的靶点并使用MM-151治疗西妥昔单抗和帕尼单抗耐药的CRC患者，ctDNA检测发现 EGFR ECD突变率降低。Russo等[39]报道了MET扩增是EGFR抑制剂耐药的机制并首次描述了p.G595R和p.G667CTrkA突变促使了携带NTRK1重排的CRC患者获得性耐药。目前的靶向药物只能针对其中的一个或几个有作用，阻断了肿瘤转移的一个通路，肿瘤细胞就会向其他通路转移，所以肿瘤耐药问题是一个非常大的挑战。目前常联合使用新药物或者新疗法作为二线治疗，如使用逆转剂，天然药物治疗，免疫治疗，基因治疗，反义RNA技术，核酶技术以及RNA干扰技术等等。

4 小结与展望

大部分肿瘤患者无法进行组织活检和肿瘤异质性是临床个体化诊疗面临的主要难题，同一病灶内的不同细胞间存在差异、原发灶与转移灶之间存在差异、不同转移灶之间也可能存在差异，这些都给组织活检带来了挑战。ctDNA的遗传信息与肿瘤保持着高度一致性，一定程度上可克服肿瘤时间和空间异质性，且ctDNA检测具有微创、非侵入式、半衰期短、特异性高、敏感性高、方便、经济以及无放射性污染等优点，尤其突出的是能其够及时跟踪肿瘤分子的进化，在不同的时间点被多次和无损地进行研究。通过对ctDNA进行测序，可以分析其突变类型与数量，实现肿瘤早期诊筛，确定对该突变类型敏感的靶向药和治疗手段，评估肿瘤治疗与预后，指导用药并监测耐药的发生等，最终形成更具个性化和组合性的治疗方案。然而，不同的ctDNA检测方法有着不同的指标，无固定的标准，适用的人群和癌种也不一样。此外，与肿瘤组织比较，ctDNA中特定基因改变检出的可靠性及稳定性仍需进一步验证。相信在不久的将来，随着更大规模、更长周期的临床研究，ctDNA检测将逐步发展成熟并形成标准化，在临床领域展现其更高的应用价值。