Mansonone F对人宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响

晁晶，齐翌婷

(遵义医学院第五附属医院，广东珠海519090)

宫颈癌是女性生殖道患病率最高的恶性肿瘤，严重危害女性健康。目前针对宫颈癌的治疗药物普遍存在选择性差、毒性大的缺点。寻找高选择性、低毒副作用的抗肿瘤药物已成为国内外研究的热点。Mansonone类化合物是一类具有氧杂并苯并吡喃醌类的天然产物，主要从梧桐科植物曼森梧桐和榆科植物无毛榆的心材中分离得到[1]。目前国内外对Mansonone类化合物的研究主要集中在抗微生物活性方面，关于抗肿瘤的研究较少，仅限于细胞毒活性及凋亡通路的研究[2～4]。Mansonone F是Mansonone类化合物之一，研究证实其具有显著的抗肿瘤细胞增殖和侵袭的作用，在肿瘤细胞和人正常细胞间具有良好的选择性[4]。探讨Mansonone F的抗肿瘤作用及机制，对开发新型抗肿瘤药物具有重要意义。黏着斑激酶(FAK)是细胞信号传导过程中重要的非受体酪氨酸蛋白激酶，与细胞的各种生命活动密切相关，并参与肿瘤的侵袭和转移[5～8]。2017～2018年，我们观察了Mansonone F对人宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和转移的影响，并探讨其对FAK表达的调控作用，为Mansonone F用于宫颈癌的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 人宫颈癌Hela细胞购自中山大学动物实验中心细胞库。Mansonone F购自阿法埃莎(天津)化学有限公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，4 ℃避光保存。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自杭州四季青生物工程材料有限公司，MTT购自上海晶纯试剂有限公司，Annexin Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒、Transwell小室购自南京建成生物工程研究所，FAK、p-FAK、β-actin抗体购自Sigma公司，RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司，PCR引物由上海生工公司合成。倒置荧光显微镜为德国衡桥仪器卡尔·蔡司股份公司产品，全波长酶标仪为美国通用电气公司产品，流式细胞仪为美国贝克曼公司产品，PCR仪为罗氏诊断产品(上海)有限公司产品。

1.2 细胞培养与分组 将细胞加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃ 5% CO2、饱和湿度培养箱中连续传代培养。将细胞分为Mansonone F组和对照组。

1.3 细胞增殖抑制率测算 采用MTT法。取对数生长期细胞，加入胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×104/mL，按5×103/孔接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。吸弃培养基，Mansonone F组分别加入终浓度为2.5、5、10 μmol/L的Mansonone F，对照组不加Mansonone F，每组设3个平行孔，并设不加药物的空白孔。分别于培养24、48、72 h后，进行MTT反应，用酶标仪在490 nm处测OD值，计算细胞存活率。细胞存活率=(试验组细胞OD值-空白孔细胞OD值)/(对照组细胞OD值-空白孔细胞OD值)×100%。细胞增殖抑制率=1-细胞存活率。

1.4 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。将细胞按5×104/孔接种于6孔板，Mansonone F组分别加入终浓度为2.5、5、10 μmol/L的Mansonone F，对照组不加Mansonone F。作用24 h后收集细胞。依次加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染液，室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测，采用ModFit LT软件分析细胞凋亡率。

1.5 细胞侵袭能力观察 采用Transwell小室实验。将Matrigel基质胶加入无血清培养基稀释，对小室底部膜进行包被、水化。收集细胞，Mansonone F组分别用无血清的含有2.5、5、10 μmol/L Mansonone F的培养液调整细胞密度为5×105/mL，对照组加入无血清的培养液。取200 μL加入Transwell上室中，同时取500 μL含20%胎牛血清的培养液加入Transwell下室中。孵育12 h，随后取出Transwell小室，PBS洗涤，甲醇固定15 min，结晶紫室温染色40 min。用水冲洗取多余的染液，晾干后，显微镜下拍照。每个小室选取5个视野，计数细胞数量。

1.6 细胞迁移能力观察 采用Transwell小室实验。除不铺Matrigel基质胶外，其他步骤与1.5相同。

1.7 细胞FAK mRNA检测 采用RT-PCR法。取对数生长期细胞，接种于6孔板中，调整细胞密度为5×104/孔。Mansonone F组分别加入终浓度为2.5、5、10 μmol/L的Mansonone F，对照组不加Mansonone F。孵育48 h后收集细胞。采用TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。取逆转录产物进行RT-PCR。PCR扩增体系(20 μL)：2 μL 10×PCR缓冲液，0.15 mol/L β-actin引物，1.5 mol/L FAK引物，500 mol/L dNTPs，1 U Taq DNA聚合酶，3 μL逆转录产物模板，双蒸水补齐体积。PCR反应条件：95 ℃变性1 min；95 ℃ 5 min，36个循环；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，拍照，用Image J软件分析各个条带的光密度。

1.8 FAK、磷酸化黏着斑激酶(p-FAK)蛋白检测 采用Western blotting法。将细胞按5×104/孔接种于6孔板中。Mansonone F组分别加入终浓度为2.5、5、10 μmol/L的Mansonone F，对照组不加Mansonone F，孵育48 h后收集细胞。加入细胞裂解液，收集蛋白样本，用考马斯亮蓝法测定样品蛋白浓度。加入SDS-PAGE上样缓冲液进行电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭。加入一抗4 ℃孵育24 h，加入二抗，室温孵育30 min。采用ECL化学发光法观察结果，采集图像，用Image J软件分析各个条带的光密度。

2 结果

2.1 不同Mansonone F浓度作用后的细胞增殖抑制率比较 对照组细胞体外生长状态良好。Mansonone F组细胞增殖抑制率较对照组升高(P<0.05或<0.01)，作用48 h时的细胞增殖抑制率高于24 h，作用72 h时的细胞增殖抑制率高于24、48 h(P均<0.01)；10 μmol/L浓度作用下的细胞增殖抑制率高于5、2.5 μmol/L，5 μmol/L浓度作用下的细胞增殖抑制率高于2.5 μmol/L(P均<0.01)。见表1。

表1 不同Mansonone F浓度作用后的细胞增殖抑制率比较

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与2.5 μmol/L Mansonone F比较，cP<0.01；与同等浓度下24 h时比较，dP<0.01；与同等浓度下48 h时比较，eP<0.01。

2.2 不同Mansonone F浓度作用后的细胞凋亡率比较 Mansonone F组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率均高于对照组(P<0.05或<0.01)；10 μmol/L浓度作用下的细胞凋亡率高于5、2.5 μmol/L，5 μmol/L浓度作用下的细胞凋亡率高于2.5 μmol/L(P均<0.01)。见表2。

表2 不同Mansonone F浓度作用后的细胞凋亡率比较

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与2.5 μmol/L Mansonone F比较，cP<0.01。

2.3 不同Mansonone F浓度作用后的细胞侵袭和迁移能力比较 Mansonone F组侵袭实验和迁移实验的穿膜细胞数均少于对照组(P<0.05或<0.01)；10 μmol/L浓度作用下的穿膜细胞数少于5、2.5 μmol/L，5 μmol/L浓度作用下的穿膜细胞数少于2.5 μmol/L(P均<0.01)。见表3。

表3 不同Mansonone F浓度作用后的细胞侵袭和迁移能力比较(个，

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与2.5 μmol/L Mansonone F比较，cP<0.01。

2.4 不同Mansonone F浓度作用后的细胞FAK mRNA及蛋白表达比较 Mansonone F组细胞FAK mRNA及FAK、p-FAK蛋白表达均低于对照组(P<0.05或<0.01)；10 μmol/L浓度作用下的FAK mRNA及FAK、p-FAK蛋白表达低于5、2.5 μmol/L，5 μmol/L浓度作用下的FAK mRNA及FAK、p-FAK蛋白表达低于2.5 μmol/L(P均<0.01)。见表4。

表4 不同Mansonone F浓度作用后的细胞FAK mRNA及蛋白表达比较

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与2.5 μmol/L Mansonone F比较，cP<0.01。

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。目前临床上治疗宫颈癌仍然是传统的放疗、化疗及手术治疗。化疗药物费用高昂，长期使用易导致耐药性。中医药治疗肿瘤历史悠久，已成为肿瘤综合治疗的重要组成部分，从传统中药中寻找高效低毒的肿瘤治疗药物已成为研究的热点。近年来，Mansonone F在抗肿瘤方面的作用受到研究者的关注。Johnson等[2]报道，Mansonone F能够抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移，并诱导其凋亡。但Mansonone F对宫颈癌的影响鲜见报道。本研究观察了Mansonone F对宫颈癌增殖、凋亡、侵袭、转移的影响，并探讨其作用机制。

肿瘤细胞与正常细胞的不同在于，肿瘤细胞为低分化细胞，生长速度快，且较正常细胞松散，易发生转移、侵袭，进而发生肿瘤的转移。控制肿瘤转移最重要的方式是抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，促进其凋亡。本研究结果显示，对于人宫颈癌Hela细胞，Mansonone F能够呈浓度和时间依赖性的抑制其增殖；流式细胞仪检测发现随着药物浓度的增加，Hela细胞早期和晚期凋亡率均逐渐上升；而在非毒性浓度条件下，Transwell小室实验发现Mansonone F能够显著抑制Hela 细胞的侵袭和迁移，其中10 μmol/L浓度下的穿膜细胞数最少。上述结果证实Mansonone F能够抑制Hela细胞的增殖、侵袭和迁移，具有显著的体外抗宫颈癌作用。

FAK属于蛋白酪氨酸激酶超家族，它是整合素介导的信号转导途径的中心分子，是细胞内外信号传导的中枢，介导多个信号传导通路，其在细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移中发挥重要作用[9～12]。FAK与肿瘤细胞侵袭、转移的过程密切相关，可作为肿瘤侵袭转移的早期标志物。研究证实，抑制FAK表达可有效抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[13，14]。本研究结果显示，Mansonone F处理Hela细胞24 h后，可明显下调FAK mRNA及蛋白表达，抑制FAK磷酸化水平；随着药物浓度的增加，FAK mRNA及蛋白表达水平随之下调。因此认为，下调肿瘤细胞内FAK mRNA表达，抑制其磷酸化水平可能是Mansonone F抑制Hela细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制其侵袭和转移能力的机制之一。

综上所述，Mansonone F对人宫颈癌Hela细胞有显著的增殖抑制和凋亡诱导作用，并能抑制细胞侵袭和迁移，其机制可能与调控FAK的表达和翻译有关。该研究为Mansonone F的抗肿瘤作用及机制提供了新的思路，对开发新型抗肿瘤药物具有重要意义。