植入前遗传学检测技术在单基因病和染色体平衡易位中的应用进展

史达源，徐家伟，孙莹璞

(郑州大学第一附属医院生殖医学中心，河南省生殖与遗传重点实验室，郑州 450052)

遗传性疾病是导致新生儿出生缺陷的重要原因之一，目前部分遗传病缺乏有效的治疗方法。《中国出生缺陷防治报告2012》[1]指出，我国出生缺陷发生率约为5.6%，每年新增出生缺陷约90万例，包括单基因病和染色体病的新生儿，给患者家庭造成了极大的负担。近年来，植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)技术的发展逐步应用于单基因病、染色体病等遗传性疾病的预防，为高龄和反复流产的患者带来了希望，通过对植入子宫前的胚胎进行遗传学检测，选择不携带致病基因和异常染色体的整倍体胚胎移植，能够提高IVF患者的妊娠率，阻断遗传性疾病向子代传递。

一、PGT技术的进展

1990年国际首例PGT试管婴儿诞生[2]，标志着试管婴儿技术出现突破性进展，遗传病患者可以生育健康后代。早期，针对遗传病和反复不孕患者的PGT分为两部分：植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)和植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening，PGS)[3]。PGD适用于单基因病和染色体病的患者，PGS适用于女方高龄、反复流产、反复种植失败和严重男性因素不育的患者。2017年，国际辅助生殖技术监控委员会对PGT进行了新的分类，包括三部分：植入前胚胎单基因遗传学检测(PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M)、植入前胚胎染色体结构变异遗传学检测(PGT for chromosomal structural rearrangement，PGT-SR)和植入前胚胎非整倍体遗传学筛查(PGT for aneuploidy，PGT-A)[4]。单基因病患者携带的致病基因遗传给子代，会导致子代患病，加重家庭负担。PGT-M可以筛选出不携带致病基因的胚胎用于移植，获得健康后代。易位、倒位、重复、缺失等染色体结构异常的患者会形成染色体核型不平衡的配子和胚胎，导致胚胎反复种植失败和早期流产[5-6]。PGT-SR可以发现胚胎的拷贝数变异(CNV)，移植不携带缺失和重复的整倍体胚胎。非整倍体作为人类胚胎中最常见的遗传学异常，是导致早期流产最常见的原因之一[5，7]。对于接受IVF助孕的患者，PGT-A尤其适用于女方高龄、反复流产、反复种植失败和严重男性因素不育的患者[3]。

随着PGT技术的发展，检测准确性不断提高，患者的临床结局获得改善。早期，通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)进行PGT-A，评估染色体整倍性，但由于其检测染色体数目有限和卵裂球活检对胚胎的影响，未能改善IVF结局[8]。定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)在4 h内快速检测24条染色体的整倍性，可在同一周期行新鲜胚胎移植[9]。近年来，单细胞全基因组扩增技术的发展可以对24条染色体进行全部染色体筛查(comprehensive chromosome screening，CCS)。微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization，aCGH)技术可检测全部染色体的非整倍体和大于10 Mb的非整倍体片段[10-11]。单核苷酸多态性微阵列(single nucleotide polymorphism array，SNP array)芯片覆盖了基因组上约300 000个SNPs位点，能检测全部染色体的拷贝数变异、微重复微缺失、单基因病和单亲二倍体[12-13]。二代测序(next generation sequencing，NGS)技术因其高通量、低成本、边合成边测序等优势被广泛应用，能检测全部染色体的非整倍体、嵌合体、基因组和线粒体拷贝数变异、单基因病[14]。

目前广泛使用的PGT技术存在一定局限性。单细胞全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)由于起始DNA量少，可能引起等位基因脱扣(allele dropout，ADO)，杂合子中的一个等位基因扩增失败，导致该位点被错误检测为纯合子，影响诊断准确性。染色体相互易位和罗氏易位是引起出生缺陷、不孕和反复流产的常见原因。CCS技术可以检测全部24条染色体整倍性，但无法区分正常核型与携带染色体易位的整倍体胚胎。移植易位携带状态的胚胎会使子代同样遭受反复流产和不孕的风险。针对以上问题，近来有新技术方法能够减少误诊、提高诊断准确性。

二、PGT技术在单基因病阻断中的应用

目前已知有7 000多种单基因遗传病，超过一半有明确的致病基因[15]。大部分单基因病会导致先天畸形、疾病或死亡，给患者家庭和社会医疗保健系统带来沉重负担。罕见病是一类严重影响人类健康的疾病，80%由于基因缺陷导致[16]，具有基因缺陷的罕见病患者通过PGT-M可以获得健康后代。1990年第一例PGT-M通过扩增Y染色体特异性重复序列，移植不包含Y染色体的胚胎，避免了X连锁隐性遗传病患者生育患病子代[2]。自PGT-M诞生以来，经历了20多年的临床应用，成功阻断了杜氏肌营养不良、苯丙酮尿症、多囊肾、Alport综合征等多种单基因疾病向子代传递。近年来，单基因病检测技术不断提高，能准确识别携带致病基因的染色体，并检测拷贝数变异。

1.Karyomapping技术识别携带致病基因的染色体：WGA的局限性之一是ADO。Karyomapping技术通过对双亲、待测胚胎和患病亲属DNA进行SNP分析，能够检测遗传物质的亲本来源[17-18]，有效降低了ADO导致的误诊。该技术首先要寻找亲本中携带者为杂合、另一方为纯合的有效SNPs，然后与患病亲属的SNPs进行比较，确定携带致病突变的单体型。最后，根据胚胎中SNPs，筛选出不携带致病突变的胚胎用于移植。

该技术的优势在于，能同时诊断单基因病和胚胎非整倍体，已成功应用于多种遗传病的植入前诊断，并获得健康新生儿[19-20]。然而，Karyomapping技术存在一定的局限性：需要患病亲属的DNA样本进行连锁分析；如果突变基因附近发生染色体重组，可能会导致SNP位点失效；对于近亲结婚的患者，需要结合传统PCR技术进行验证。

2. 非整倍体测序与连锁分析(mutated allele revealed by sequencing with aneuploidy and lingkage analyses，MARSALA)同时检测单基因病和胚胎非整倍体：MARSALA是Yan等[21]研发的一种基于二代测序的PGT技术，能同时检测单基因病和染色体异常，并进行连锁分析。该技术将囊胚滋养外胚层活检细胞通过多次退火环状循环扩增技术(MALBAC)进行全基因组扩增，然后针对基因突变区域进行特异性扩增，运用低测序深度(0.1-2X)的二代测序准确检测染色体整倍性和单核苷酸变异。目前，MARSALA技术已成功应用于常染色体显性、隐性遗传病和X连锁遗传病患者，并且获得了不携带致病基因的健康新生儿[22]。

Wu等[23]在经典MARSALA的基础上，对多个单精子进行全基因组扩增，3X测序深度寻找有效SNP进行连锁分析，无需特定引物和患病家庭成员的检测。运用单精子连锁分析，该团队为β地中海贫血相关基因HBB均为杂合突变的夫妇移植了不携带突变的整倍体胚胎，获得了临床妊娠，并且羊水检测证明了该技术的准确性。传统的NGS技术检测点突变需要30X测序深度。MARSALA技术使用低测序深度能同时检测非整倍体和突变位点，测序成本低，但该技术无法检测新发突变。

3.qPCR特异性检测突变位点：TaqMan qPCR为基础的PGT技术，成本低，可以广泛应用，且其可同时检测单基因病和非整倍体，能够在4～6 h内完成检测，因此患者可以在子宫内膜容受性移植窗内进行新鲜胚胎移植。该技术具有极低的ADO发生率和极高的结果一致性，无需进行全基因组扩增，使用TaqMan探针通过位点特异性扩增可以直接靶向检测突变位点。

有研究运用TaqMan qPCR对43例单基因病患者的304枚胚胎进行PGT，筛选出39枚不携带致病基因的整倍体胚胎进行移植，最终有27位患者成功分娩[24]。然而，脆性X综合征和亨廷顿舞蹈病等疾病存在三核苷酸重复，无法通过qPCR基因型探针直接检测突变，需要对患者家系突变基因附近的SNPs进行连锁分析。对于TaqMan qPCR可以直接检测的突变，连锁分析可以避免ADO造成的误诊。

4.长读长测序(long read sequencing)在长片段结构变异的单基因病中的应用：目前，通常使用全外显子组测序(WES)或全基因组测序(WGS)检测单基因遗传病的突变位点，但由于模板DNA捕获效率不足、测序覆盖偏倚等问题，某些结构变异未被发现。Miao等[25]通过Nanopore全基因组长读长测序技术，发现了WES短读测序未能捕获到的G6PC等位基因上的7.1 kb杂合缺失，结合WES检测到的另一个等位基因上的点突变，鉴定出患者家系常染色体隐性遗传方式的糖原贮积病Ia型的发病原因和致病基因来源。联合定量PCR和微卫星连锁分析，筛选出仅携带母源点突变的胚胎进行移植，成功分娩了一个健康女婴。

长读长测序技术，具有超长读长、极低GC偏好性等优势，可以精确检测结构变异、串联重复序列，弥补了短读测序的不足[26-27]。虽然长读长测序技术检测时间长、成本高，但对于人类基因复杂序列拼接和致病性的人类基因组结构变异检测有巨大潜力，可有效阻断单基因病和复杂结构变异向子代传递，在未来PGT中有重要发展前景。

三、PGT技术在染色体平衡易位胚胎识别中的应用

染色体平衡易位在人群中的发生率约为0.2%，绝大部分因染色体组成未改变而表型正常，少部分易位染色体的断裂破坏了基因功能，导致不孕、疾病综合征和先天畸形。减数分裂时期，易位染色体分离紊乱，产生约70%不平衡配子，导致反复流产或新生儿染色体异常。运用断裂区域DNA探针的FISH技术和短串联重复序列(short tandem repeats，STR)单体型分析可以鉴别易位携带者，但无法进行全部染色体筛查[28]。对于反复流产和希望生育染色体核型正常后代的患者，尤其需要能区分易位携带状态和正常胚胎的PGT技术。

1. 显微切割和二代测序(MicroSeq)准确检测染色体易位断裂点：Hu等[29]使用激光显微切割技术识别易位断裂点及其连锁的SNPs位点，建立了一种能够精准定位染色体平衡易位断裂点的方法，筛选出正常胚胎并成功应用于PGT。该技术能够对易位附近的重排染色体进行显微切割和二代测序，通过靶向PCR和Sanger测序精准检测断裂点及附近SNPs，利用有效SNPs进行连锁分析，筛选出不携带染色体易位的正常胚胎。然而，该技术需要高度特异性的设备和复杂的样本制备程序，难以应用于高通量的临床检测。

2. 等位基因映射识别技术(mapping allele with resolved carrier status，MaReCs)在染色体平衡易位胚胎识别中的应用：MaReCs是一种以NGS为基础的方法，运用连锁分析识别与易位相关的等位基因，能够鉴别易位携带状态的胚胎[30]。该技术运用MALBAC和NGS对活检细胞进行全基因组扩增和测序，通过拷贝数变异识别染色体非平衡胚胎中发生易位的断裂点，在断裂点附近1 Mb区域的SNPs用于分析胚胎是否携带染色体易位，并筛选出正常胚胎用于移植。

使用MALBAC-NGS能将断裂点检测的准确性提高到200 bp，将SNPs的检测范围缩小到断裂点附近约1 Mb区域，降低了因染色体重组而导致误诊的风险。目前该技术已广泛应用于临床，保证了染色体平衡易位患者胚胎的有效筛选。由于检测需要非平衡的异常胚胎作为对照寻找断裂位点，因此该技术具有一定局限性。

3. 植入前遗传学单体型分析(preimplantation genetic haplotyping，PGH)在染色体平衡易位胚胎识别中的应用：近来有团队通过SNP基因型构建断裂区域单体型，从而识别不携带易位的正常胚胎。Wang等[31]使用Illumina Human Cyto-12芯片检测基因组SNPs，将携带易位的非平衡胚胎作为参照，通过 SNP单体型分析识别出罗氏易位携带状态的胚胎，移植了染色体正常的胚胎，并获得临床妊娠。Zhang等[32]利用SNP微阵列技术成功鉴别了平衡易位和罗氏易位携带状态的胚胎。该技术的优势在于，能够同时筛查染色体易位和23对染色体拷贝数变异；适用于全部染色体的相互易位和罗氏易位。由于该技术使用的芯片仅有300 000个SNPs位点，因此检测结果不能排除染色体重组的可能性。

BasePhasing是Zhang等[33]的团队最近报道的一项能够有效识别染色体平衡易位的技术。该团队使用Infinium Asian Screening Array-24 v1.0(ASA)芯片及优化的分析流程，对两例染色体平衡易位患者的胚胎进行了检测，通过羊水穿刺细胞遗传学分析证明了其技术的有效性。由于该芯片包含700 000个SNPs位点，因此断裂区域内的有效SNPs数目较多，可以较好的排除染色体重组的影响。

4.配对二代测序和PCR断点分析技术有效检测染色体易位断裂区域：Wang等[34]使用长范围配对测序的方法识别平衡易位断裂区域，获得了染色体核型正常的新生儿。该策略首先通过配对测序检测出包含断裂点的5 kb片段，进行巢式PCR和Sanger测序，精确检测出两个断裂点及其邻近序列。然后，对胚胎的活检DNA进行特异性PCR，并进行Sanger测序确认是否存在断裂点。

该方法无需参照，但存在几点局限性：首先，尽管测序深度高(30X)，但在11个相互易位患者中有2个未检测到断裂点；罗氏易位的断裂点往往位于高度重复的着丝粒区域而不易检测。第二，位于AT富集区域的断裂点因缺乏有效的PCR引物而无法检测；小片段缺失、插入或重复导致断点附近序列改变，使PCR引物无效。因此，明确断裂点之间额外的序列可以增加引物设计的准确性。第三，由于起始DNA量少导致ADO，可能会使易位携带状态的胚胎误诊为正常胚胎。为了提高准确性，可以同一断裂点使用两对特异性引物来降低ADO的发生率。

四、展望

PGT诞生20多年以来，在单基因病、染色体病和非整倍体检测等方面广泛应用，阻断致病基因和异常染色体向子代传递，筛选整倍体胚胎用于移植，改善了IVF患者的临床结局。随着SNP芯片技术的改进，基因组SNP检测位点增加，诊断准确性提高[33]。全基因组范围内的SNP连锁分析可以确定染色体亲本来源，能够识别携带致病基因或平衡易位的染色体，具有广泛的临床应用价值。三代测序具有超长读长、单分子测序的优势，目前已经有成功检测单基因病和染色体平衡易位的报道[25-26，35]。今后，在优化检测流程和更新测序仪器的基础上，三代测序可以为单基因病和染色体平衡易位患者提供低成本、准确有效的PGT。目前，PGT仍然存在ADO、扩增偏倚、胚胎嵌合体和外源性DNA污染等问题。因此，需要更加便捷有效和能广泛使用的技术应用于PGT，缩短患者等待时间，降低成本，提高检测准确性，改善临床结局。