水通道蛋白1、血管内皮生长因子及微血管密度在胃癌组织中的表达及临床意义*

董峰，牛跃平，郑英斌，高健

（郑州大学第二附属医院 普外科，河南 郑州 450014）

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其早期症状不典型，诊断率低，往往发现时已处于进展期。我国胃癌的年病死率为25.21/10万，在各系统恶性肿瘤的死因中居首位。在肿瘤的发生、发展及侵袭过程中，微血管的生成起到至关重要的作用。在肿瘤微血管形成过程中，需要多种促进因子及抑制因子的共同调控，本文通过研究水通道蛋白1（aquaporin-1, AQP1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、微血管密度（microvessel density, MVD）在胃癌组织中的表达及其与临床病理参数的相关性，以期为胃癌个体化治疗及其预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年9月1日—2 017年6月1日郑州大学第二附属医院进展期胃癌行胃癌根治术新鲜标本79例。男性49例，女性30例；年龄28～81岁，中位57岁；术前均未行放化疗。每例分别取癌组织和癌旁组织（距肿瘤边缘＜2 cm处），放置于中心实验室的-80℃冰箱中保存。术后病理分期，按第7版UICC-AJCC胃癌TNM分期标准：Ⅰ期13例，Ⅱ期21例，Ⅲ期38例，Ⅳ期7例；有淋巴结转移51例，无淋巴结转移28例；脉管癌栓阳性43例，脉管癌栓阴性36例。按分化程度：高分化癌11例，中分化癌24例，低分化癌39例，未分化癌5例。

1.2 主要材料及试剂

AQP1兔抗人多克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体、SP染色试剂盒及浓缩型DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3 方法

所有标本经过4%的多聚甲醛固定后，脱水，透明化处理，石蜡包埋后，连续切片（4 μm）。常规脱蜡，水化后，采取免疫组织化学二步法（SP染色），操作步骤严格按照试剂盒说明书，DAB染色，苏木精复染，干燥后脱水，透明，封片。以PBS代替一抗做阴性对照，以已知阳性结果做为阳性对照。

1.4 判定标准

AQP 1：以细胞膜被染色为棕黄色为阳性，VEGF：阳性为细胞膜或细胞质上出现黄色或棕黄色染色，每个切片有大于5%的胞膜或胞质染色，即可判定为VEGF阳性表达。MVD：首先在低倍镜（×40）下选取血管密集区，然后在高倍镜（×200）下选取3个视野，对新生血管进行计数，最后取其平均值即为MVD。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，运用Spearman进行组间相关性分析，比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP1、VEGF、MVD在胃癌组织与癌旁组织中的表达

AQP1、VEGF在胃癌组织的表达与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05），胃癌组织的表达高于癌旁组织组；MVD在胃癌组织的表达与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05），胃癌组织的表达高于癌旁组织。见附图和表1。

附图 AQP1、VEGF、MVD在胃癌组织中的表达 （×200）

表1 AQP1、VEGF、MVD在胃癌组织与癌旁组织中的表达 （n =79）

2.2 AQP1与VEGF相关性分析

在AQP1阴性表达的胃癌组织中，V EGF阳性表达率为33.33%（7例），在AQP1阳性表达的胃癌组织中，VEGF阳性表达率为84.48%（49例），通过Spearman进行相关性分析，AQP1与VEGF在胃癌组织中的表达呈正相关（rs=0.497，P＜0.05）。见表2。

2.3 AQP1及VEGF与MVD在胃癌组织中表达比较

AQP1阳性表达的胃癌组织MVD值与AQP1阴性表达的胃癌组织MVD值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MVD在AQP1阳性表达的胃癌组织中的表达高于AQP1阴性表达的组织。VEGF阳性表达的胃癌组织MVD值与VEGF阴性表达的胃癌组织中MVD表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MVD在VEGF阳性表达的胃癌组织中的表达高于AQP1阴性表达的组织。见表3。

表2 AQP1与VEGF相关性分析 例

表3 AQP1及VEGF与MVD在胃癌组织中表达比较（±s）

表3 AQP1及VEGF与MVD在胃癌组织中表达比较（±s）

组别 n MVD值 t值 P值AQP1阳性 58 44.16±4.52-8.146 0.000阴性 21 34.80±4.44 VEGF阳性 56 44.31±4.65-8.260 0.000阴性 23 35.17±3.98

表4 AQP1、VEGF的表达与临床病理参数的关系 例（%）

2.4 AQP1、VEGF与MVD的表达与临床病理参数的比较

AQP1、VEGF的表达与胃癌的分化、淋巴结转移、脉管癌栓及分期有关（P＜0.05），与肿瘤大小无关（P＞0.05）（见表4）；MVD的表达与胃癌的分化、淋巴结转移、脉管癌栓及分期有关（P＜0.05），与肿瘤大小无关（P＞0.05）（见表 5）。

表5 MVD的表达与临床病理参数的关系 （±s）

表5 MVD的表达与临床病理参数的关系 （±s）

临床病理参数 n MVD值 t值 P值肿瘤大小≤5 cm 47 42.15±6.03 8.920 0.375＞5 cm 32 40.90±6.21分化程度高、中分化 35 37.82±4.70 5.980 0.000低、未分化 44 44.69±5.35淋巴结转移有51 43.15±5.79 3.111 0.003无28 38.91±5.78脉管癌栓有43 45.87±3.44 10.324 0.000无36 36.60±4.53分期Ⅰ、Ⅱ期 34 36.34±4.26 10.303 0.000Ⅲ、Ⅳ期 45 45.62±3.76

3 讨论

在动植物及微生物的体内存在一种特异性水通道蛋白，被称作水通道蛋白（Aquaporins, AQPs），其广泛分布于机体的多个器官，以满足机体组织的生理需求，且其在细胞的生命活动及凋亡过程中，也发挥至关重要的作用[1]。已有文献报道[2]AQP1与如乳腺癌、膀胱癌、喉癌、黑色素瘤等多种肿瘤的发生密切相关。赵子伟等[3]在研究过程中发现AQP1在结直肠癌中的阳性表达率高于癌旁组织，提示AQP1对结直肠癌的发生发展密切相关。同时又有研究[4]指出VEGF与AQP1在非小细胞肺癌中的表达比癌旁组织高，且具有一定相关性，推测在肿瘤的生长过程中，AQP1通过与VEGF的互相作用，促进肿瘤的浸润与转移。本研究中AQP1在胃癌组表达阳性率高于癌旁组织中阳性表达率，差异有统计学意义；胃癌组织中AQP和VEGF的表达呈正相关，提示两者在胃癌的发生、发展过程中具有协同作用。

在人体内，多种细胞均能表达VEGF，在促进血管内皮细胞生长、诱导新生血管形成及调节血管的发展过程中起着关键作用，是目前己知的最重要的血管活性因子之一，而血管的生成在癌细胞的生长、浸润、转移过程中起着重要作用。SIMONETTI等[5]发现VEGF在肿瘤组织中的表达高于正常组织，认为VEGF能促进肿瘤微血管形成，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用。本实验中，胃癌组织中VEGF的表达高于癌旁组织；VEGF阳性表达的胃癌组织中的MVD表达高于VEGF阴性表达的组织，推测VEGF与MVD在胃癌组织中表达呈正相关，VEGF参与肿瘤新生血管形成，在癌变形成及以后的浸润及转移过程中起重要的作用。

MVD能良好的反应肿瘤微血管生成的状态，目前已被广泛应用与临床和基础实验当中。在多种恶性肿瘤组织中MVD均为高表达，但在正常器官、组织和大血管等位置，其表达能力降低[6]。GRIGORE等[7]在研究中发现恶性肿瘤中的MVD表达程度高，其与肿瘤微血管形成关系密切。本研究中的胃癌组织中MVD与癌旁组织比较，差异有统计学意义，说明MVD与恶性肿瘤关系密切，其可能参与肿瘤的发生发展。在研究胃癌组织中MVD与AQP1表达时，笔者发现有关两者间相关性的研究尚少，但本实验中AQP1阳性表达的胃癌组织中，MVD表达高于AQP1阴性表达的组织，差异有统计学意义，故可预测在胃癌组织中，AQP1与MVD的表达可能存在正相关关系，两者共同参与了胃癌的发生、发展过程，但相关资料尚不足，有待进一步研究。

在肿瘤的发生、发展过程中，需要大量的水和营养物质，在肿瘤细胞中高表达的AQP1可改变肿瘤的形态、体积及细胞上皮渗透压，从而协助肿瘤的生长，加快肿瘤向周围组织浸润[8]。CHANG等[9]发现，胃癌组织中VEGF和MVD表达强度与Borrmann型、肿瘤分化、肿瘤侵袭、淋巴结转移、TNM分期相关，VEGF和MVD高表达的患者总体生存率低于VEGF和MVD低表达的患者。CARVALHO等[10]报道MVD表达程度高的乳腺癌患者远处转移和术后复发的风险增高；另一些研究显示，随着MVD的增加，肿瘤的生成，侵袭和转移率也都增加[11]。本研究中结果与上述报道一致，AQP1、VEGF与MVD的表达强度与肿瘤大小无关，但与胃癌的分化、淋巴结转移、脉管癌栓及分期关系密切，推断3者在肿瘤的生成、浸润、转移过程中有促进及协同作用。

综上所述，AQP1、VEGF与MVD在胃癌组织中的表达高于癌旁组织，3者之间存在协同作用，参与了肿瘤的发生发展过程，因此本研究可为肿瘤的预后评估提供一定的临床资料。此外，在抗肿瘤药物中，大多数研究都与新的靶点有关，靶向药物的开发层出不穷，以期推出新的高效靶向药物，但仍不能挽救多数晚期肿瘤患者，更无法彻底治愈肿瘤，故仍需继续深入研究，深层次探究肿瘤的发生、发展机制，为肿瘤的治疗提供新的思路。