GH/IGF1轴对非酒精性脂肪肝病脂代谢的影响及可能机制研究*

邹琳，李铁岩，钱丽娟，童学科，费悦 ，徐霞红，佘会元

（1.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004；2.同济大学附属东方医院 心脏外科，上海 200120；3.上海市浦东新区公利医院 感染科，上海 200135）

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是目前全球最常见的慢性肝病，发病率高达25%～40%，在我国城市人口中的患病率高达27%，儿童发病率为2.1%，若合并肥胖，发病率上升至68.2%[1-2]。预计到2030年NAFLD将成为肝移植的最主要原因[3-4]。脂质代谢异常以及胰岛素抵抗被普遍公认为NAFLD进展的第一重打击，同时激素代谢紊乱也与NAFLD发病密切相关[5-7]。生长激素/胰岛素样生长因子1（GH/IGF1）轴也被称为生长轴，由垂体释放的GH与肝细胞膜上的生长激素受体（GHR）相结合并通过“JAK2-STAT5b”通路促进肝细胞合成并释放IGF1，共同参与调节机体的生长、发育、代谢，以及各类激素的平衡。越来越多的研究发现[8-10]NAFLD患者，包括儿童血清中的GH水平升高、IGF1和胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）水平下降，并且IGF1、IGFBP3下降程度与NAFLD脂肪变性程度呈正相关，提示GH/IGF1轴可能参与NAFLD发病过程，GH、IGF1参与NAFLD的脂质调节[11]，但具体的调节机制仍不清楚。本实验通过复制NAFLD细胞模型，观察不同剂量的GH、IGF1干预下的肝内三酰甘油（TAG）合成和脂肪酸合成酶（FASN）、固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1C）、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPAR-γ）的变化，进一步探讨GH/IGF1轴在NAFLD中对脂代谢的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

人正常肝细胞HL-7702（L02）细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所，FBS（10270-106）购自美国Gibco公司，DMEM培养基（SH30021.01B）、双抗（SV30010）、磷酸盐缓冲溶液（PBS）（SH30256.01B）购自美国Hyclone公司，0.25%胰酶（150050-065）、Random Primer购自美国 Invitrogen 公司，DMSO（D2650）、BSA（B2064）、油酸（O1383）、棕榈酸（P5585）、油红O（O0625）染色购自美国Sigma公司，BCA法蛋白检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司，TAG测 试 盒、Trizol（B610409-0100）、DEPC原 液（B548110-0200）购自南京建成生物工程研究所，人重组IGF-I（100-11）、人重组GH（100-40）购自美国 peprotech 公司，IGF1（E04580h）、IGFBP3（E04590h）试剂盒购自美国CUSABIO公司，三氯甲烷（氯仿）（分析纯AR，500 ml）、无水乙醇分析纯AR（500 ml）购自上海国药集团化学试剂有限公司，异丙醇分析纯AR（500 ml）购自上海展云化工有限公司，dNTPs购自上海兆维科技发展有限公司，M-MLV M170B、Oligo dT（50 μmol）购自美国Promega公司，RNasin（2313A）、SYBR Green I qPCR mix购自日本TaKaRa公司，引物购自上海捷瑞生物合成公司。

1.2 仪器与设备

二氧化碳CO2培养箱（美国Thermo公司），倒置显微镜（日本Nikon公司），7500 real-time PCR仪（美国Applied Biosystems公司），酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞解冻、传代 液氮中取出冻存L02细胞，37℃水浴中解冻，冷冻细胞刚解冻为液体时迅速取出，在生物安全柜中转移到15 ml离心管中，加入5 ml培养基，1 000 r/min离心5 min，吸去上清液，细胞沉淀重悬5 ml培养基中，转移到T25培养瓶中，上下左右混匀，放入5% CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞，当细胞生长至70%～80%融合度时，进行传代。吸去培养基，PBS清洗2次，加入0.25%胰酶溶液，孵育1～5 min，显微镜下观测消化进程，观察到细胞变圆，轻拍培养瓶有少量细胞漂起即可加入含血清培养基终止消化，重悬消化细胞，转移到15 ml离心管中，1 000 r/min离心5 min收集细胞，按1∶3或1∶4比例接种到新培养瓶中培养。

1.3.2 NAFLD细胞模型复制 将油酸和软脂酸按2∶1比例配成20 nmol FFA母液，并加入到DMEM高糖完全培养液中，配成1 mmol的高脂完全培养基，细胞贴壁后放入高脂培养基中，继续放置在5% CO2的37℃恒温培养箱中继续培养。诱导24、48及72 h后收获细胞，称取0.25 g油红O干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至50 ml，配成油红O染色液进行细胞染色。染色时，吸去细胞培养液，用PBS轻柔漂洗后加入10%中性甲醛固定15 min，然后用油红O染液染色10 min，PBS漂洗后用苏木精复染5 min，双蒸水（ddH2O）漂洗后，显微镜下观察并拍照，以细胞质内出现橘红色的脂滴为脂质变性细胞。

1.3.3 rhGH和rhIGF1刺激NAFLD细胞及分组 为观察GH/IGF1轴对脂代谢影响，分别选择25 ng/ml rhGH、250 ng/ml rhGH、50 ng/ml rhIGF1、500 ng/ml rhIGF1加入正常细胞和NAFLD细胞培养中，加药24 h后开始收集细胞并进行相关检测。见表1。

表1 rhGH、rhIGF1干预浓度与分组

1.3.4 TAG检测 TAG主要采用GP-PAP酶法检测。将制备好的GH、IGF1干预后的L02细胞、NAFLD细胞以及未加药组的细胞悬液分别取出，1 000 r/min，离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀；用PBS清洗2次，同样1 000 r/min，离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀。将收集的细胞采用1%的Triton X-100进行化学裂解，分别在细胞收集样本中加入200 μl，冰水浴条件下裂解30 min。将裂解后的细胞混合液分成2部分，一部分采用BCA法蛋白定量，一部分进行TAG检测，将各2.5 μl的裂解细胞悬液分别加入96孔板中，并设置空白对照以及2.26 mmol/L标准品（甘油）对照；分别加入250 μl工作液，充分混匀后37℃孵育10 min，反应达到平衡后颜色在60 min内稳定。空白管调测OD值，采用酶标仪测量标准孔及待测样品500 nm的OD值，绘制标准曲线并计算TAG浓度。

1.3.5 实时荧光定量聚合酶链反应（qR T-PCR）采用Trizol法提取NAFLD细胞总RNA，通过Nanodrop ND-2000鉴定提取的RNA浓度以及纯度，确定后进行mRNA逆转录，先按RNA 1 μg，Oligo dT（50 μmol）1 μl，Rnase-Free-H2O 加至 10 μ l配置反应液一，并在70℃孵育5 min，然后迅速冰浴3 min，将反应液一，5×M-MLV buffer 4 μl，M-MLV（200 u/μl）1 μl，RNasin（40 u/μl）0.25 μl，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μl，并Rnase-Free-H2O加至20 μl，配置后混匀，采用42℃ 60 min，70℃ 15 min反应条件进行逆转录，获得的cDNA放入-20℃冰箱冷冻保存。将cDNA稀释10倍，通过Primer 5.0软件设计引物序列（见表2），β-actin作为内参设置对照，qRT-PCR反应体系：样本 cDNA 2 μl，10 μmol正向引物 0.4 μl，10 μmol反向引物 0.4 μl，SYBR Green I qRT-PCR mix 10 μl，ddH2O加至20 μl反应体系，反应程序：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40个循环，熔解曲线。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表2 PCR引物列表

1.3.6 细胞上清液中IGF1、IGFBP3含量检测 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测上清液IGF1、IGFBP3含量，将制备好的L02细胞和NAFLD细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，弃细胞，留取上清液待测；进行标准品的制备，使标准品稀释浓度分别为500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8 和 0.0 ng/ml，在 96孔板的酶标板孔中分别加入空白对照，标准品以及样品100 μl，37℃温浴2 h后，分别加入100 μl酶Biotin抗体，37℃温浴1 h并洗涤5次，依次加入100 μl的显色剂HRP，37℃温浴1 h并洗涤5次和90 μl的显色剂TMB，避光，37℃温浴30 min后加入50 μl终止液，450 nm波长进行测量。

1.4 统计学方法

数据分析采用Graphpad Prism 5.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，多时间点比较采用重复测量设计的方差分析，非正态分布采用Wilcoxon、Mann-WhitneyU检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NAFLD细胞模型制备

1 nmol FFA高脂培养基培养L02细胞24、48和72 h后，通过倒置显微镜可见L02组的细胞边缘清晰可见，核大，其内可见核分裂相，核膜完整，细胞胞浆丰富，油红O染色后，仅在细胞边缘可见少量小的红染脂滴。L02 NAFLD组可见细胞变圆，胞浆内及细胞周围可见大量红染的脂滴，细胞核大，部分被挤到一侧，呈印戒样改变。见图1。

图1 L02组和L02 NAFLD组细胞脂滴沉积情况（油红O染色×400）

2.2 NAFLD细胞GH/IGF1轴功能改变

2.2.1 GHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表达比较 L02 NAFLD组细胞中GH/IGF1轴功能抑制与L02组比较，差异有统计学意义，其中GHR mRNA表达高于L02组（P＜0.05）。IGFBP3 mRNA 表达低于 L02组（P＜0.05），IGF1 mRNA 表达差异无统计学意义（P＞0.05），L02 NAFLD组轻度减少。见表3和图2。

2.2.2 IGF1、IGFBP3蛋白表达比较 两组细胞上清液中IGF1、IGFBP3的蛋白表达见图3。24 h时，两组上清液中IGF1、IGFBP3未见明显差异。48 h时，L02 NAFLD组与L02组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），L02 NAFLD组IGF1和IGFBP3均低于L02组（见表4）。

表3 两组细胞CHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表达比较（±s）

表3 两组细胞CHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表达比较（±s）

组别 CHR IGF1 IGFBP3 L02 组 0.539±0.095 0.385±0.086 0.867±0.112 L02 NAFLD组 0.854±0.103 0.366±0.045 0.359±0.069 t值 2.238 0.186 3.613 P值 0.040 0.855 0.002

图2 两组细胞GHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表达 （±s）

图3 两组细胞IGF1、IGFBP3蛋白表达水平 （±s）

表4 两组细胞48 h IGF1、IGFBP3蛋白表达比较（±s）

表4 两组细胞48 h IGF1、IGFBP3蛋白表达比较（±s）

组别 IGF1 IGFBP3 L02组 0.385±0.086 0.359±0.069 L02 NAFLD 组 0.366±0.045 0.867±0.112 t值 23.370 4.410 P值 0.002 0.037

2.3 TAG含量比较

两组细胞中24、48和72 h的TAG含量比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的TAG含量有差异（F=229.91，P=0.000）；②L02 NAFLD组和L02组的TAG含量有差异（F=616.96，P=0.000），L02 NAFLD细胞组TAG含量升高；③L02 NAFLD组与L02组的TAG变化趋势有差异（F=629.920，P=0.000）。见表5和图4。

2.4 两组细胞FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表达比较

L02 NAFLD组中PPAR-γ和SREBP-1C mRNA与L02组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），L02 NAFLD组中PPAR-γ mRNA表达高于L02组，SREBP-1C mRNA表达低于L02组。见表6和图5、6。

表5 两组细胞TAG含量比较 （mmol/L，±s）

表5 两组细胞TAG含量比较 （mmol/L，±s）

组别 24 h 48 h 72 h L02组 0.289±0.001 0.252±0.002 0.246±0.004 L02 NAFLD 组 0.411±0.014 0.401±0.015 0.464±0.010

图4 两组细胞TAG含量比较 （±s）

表6 两组细胞FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表达比较 （±s）

表6 两组细胞FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表达比较 （±s）

组别 FASN SREBP-1C PPAR-γ L02 组 0.554±0.103 0.510±0.090 0.599±0.048 L02 NAFLD组 0.593±0.105 0.309±0.034 0.837±0.078 t值 0.267 2.790 2.580 P值 0.793 0.027 0.024

图5 两组细胞FASN、SREBP-1C mRNA表达比较 （±s）

图6 两组细胞PPAR-γ mRNA表达比较 （±s）

2.5 rhGH、rhIGF1干预后TAG含量变化

NAFLD细胞中，rhGH干预组：25 ng/ml（rhGH-L）、250 ng/ml（rhGH-H） 和 rhIGF1干 预 组：50 ng/ml（rhIGF1-L）、500 ng/ml（rhIGF1-H）分别干预24、48和72 h后，通过重复测量设计的方差分析检测TAG含量，其中L02 NAFLD组为未加药组。结果：①不同时间点的TAG含量有差异（F=172.330，P=0.000）；②不同干预组间的TAG含量有差异（F=20.460，P=0.000）；③不同干预组间的TAG变化趋势有差异（F=49.320，P=0.000）。而在正常细胞（L02）中，结果：①不同时间点的TAG含量有差异（F=15922.060，P=0.000）；②不同干预组间的TAG含量有差异（F=3958.550，P=0.000）；③不同干预组间的TAG变化趋势有差异（F=624.850，P=0.000）。见表 7 和图 7。

表7 两组细胞在不同干预条件下TAG变化（mmol/L，±s）

表7 两组细胞在不同干预条件下TAG变化（mmol/L，±s）

组别 24 h 48 h 72 h正常细胞组未干预组 0.289±0.001 0.252±0.002 0.246±0.004 rhGH-H 组 0.473±0.004 0.273±0.001 0.342±0.003 rhGH-L 组 0.463±0.005 0.268±0.002 0.320±0.001 rhIGF1-H 组 0.356±0.002 0.215±0.001 0.258±0.024 rhIGF1-L 组 0.421±0.003 0.261±0.002 0.283±0.003 NAFLD组未干预组 0.411±0.014 0.401±0.015 0.446±0.009 rhGH-H 组 0.576±0.004 0.446±0.039 0.534±0.018 rhGH-L 组 0.517±0.004 0.441±0.027 0.427±0.002 rhIGF1-H 组 0.583±0.003 0.448±0.037 0.427±0.020 rhIGF1-L 组 0.531±0.009 0.514±0.016 0.446±0.010

图7 两组细胞经rhGH、rhIGF1干预后TAG含量（±s）

2.6 rhGH、rhIGF1干预后FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表达比较

在NAFLD细胞中，与未加药组（L02 NAFLD）比较，rhGH-H，rhGH-L，rhIGF1-L干预下的NAFLD中PPAR-γ mRNA表达差异有统计学意义（t=8.990、7.530和 4.280，P=0.002、0.006和 0.012），3组干预下的PPAR-γ mRNA低于未加药组；rhIGF1-H干预下的NAFLD中SREBP-1C mRNA表达差异有统计学意义（t=-5.190，P=0.028），SREBP-1C mRNA表达高于未加药组。见表8和图8。

表8 rhGH、rhIGF1干预后FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表达比较 （±s）

表8 rhGH、rhIGF1干预后FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA表达比较 （±s）

注：†P ＜0.05

组别 FASN SREBP-1C PPAR-γ未加药组 0.623±0.266 0.364±0.048 0.923±0.058 rhGH-H 组 0.677±0.269 0.494±0.195 0.297±0.053†rhGH-L 组 0.684±0.189 0.353±0.089 0.388±0.027†rhIGF1-H组 0.782±0.295 0.973±0.197† 0.900±0.259 rhIGF1-L 组 0.746±0.271 0.465±0.162 0.443±0.185†

图8 rhGH、rhIGF1干预下NAFLD中FASN、SREBP-1C、PPAR-γ mRNA 表达比较 （±s）

3 讨论

NAFLD是累及肝脏及多个肝外组织的肝脏代谢综合征，NAFLD患者多易合并糖尿病、高脂血症、高胰岛素血症，肥胖、冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）等疾病，研究发现2型糖尿病患者合并脂肪肝的可能性高达80%，并且进展为NASH的风险较单纯脂肪肝高2～4倍[12]，NAFLD患者发生动脉粥样硬化和冠心病的风险明显升高[13]，而这些疾病与机体的脂质代谢紊乱和异常沉积密切相关。脂质代谢研究一直是NAFLD研究的重点和热点。

GH/IGF1轴在NAFLD人群表现GH抵抗，IGF1、IGFBP3水平下调，并与NAFLD的严重程度呈正相关[14-15]，血清低水平IGF1的肝癌患者的疾病进展时间缩短和生存时间更短，低水平IGF1与肝癌风险升高密切相关，且早于肝癌诊断至少5年[16]。

本研究结果提示，由FFA诱导L02细胞的NAFLD细胞模型中，IGF1、IGFBP3 mRNA以及蛋白水平均下调，机体出现GH抵抗，GH/IGF1轴功能被抑制，这与临床中观察到的GH、IGF1变化一致。NAFLD细胞中，24、48和72 h的细胞内TAG含量均较正常细胞升高，脂合成基因PPAR-γ的合成增加，PPAR-γ是脂质合成的重要调控基因，可以诱导肝内脂质堆积，促进TAG合成[17-18]，PPAR-γ及其靶点CD36可以促进游离脂肪酸的吸收，PPAR-γ的高表达可以诱导成脂性基因FASN、SREBP-1表达转录增加[19]。经不同浓度rhGH、rhIGF1干预后，可以看到正常细胞和NAFLD细胞在早期（24 h）细胞内TAG含量均升高，但72 h后时细胞内TAG含量明显下降。其中NAFLD细胞中PPAR-γ mRNA表达水平下调，说明GH、IGF1可能通过下调PPAR-γ从而减少肝细胞内脂质合成。另外，NAFLD组细胞中GHR、IGF1、IGFBP3 mRNA表达低于正常细胞，且细胞中TAG含量升高不及正常细胞，说明FFA与GH/IGF1轴之间可能存在负调控，而在人体骨骼肌中也发现，随着FFA浓度升高，骨骼肌中STAT5b磷酸化水平明显下调[20]。

综上所述，GH/IGF1轴在NAFLD中受抑制，GH/IGF1可能通过抑制PPAR-γ参与调控NAFLD中脂代谢，并与FFA之间存在负反馈调节。