双孢蘑菇育种技术研究进展*

李正鹏 李文 李巧珍 陈明杰 黄建春 王金斌

（1.上海市农业科学院，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 奉贤 201403；2.国家食用菌工程技术研究中心，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，上海 奉贤 201403）

双孢蘑菇属于真菌门（Eumycota）担子菌纲（Basidiomycetetes）伞菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）蘑菇属（Agaricus）[1～2]，在100多个国家广泛栽培，素有世界菇之称，在全球食用菌产业中占有重要地位。双孢蘑菇的生活史属二级性次级同宗配合遗传方式，双孢担子占绝大部分，单个担孢子在条件适宜时可萌发并完成营养积累，产生原基，发育子实体，散射成熟担孢子，完成整个生活史[3～4]。双孢蘑菇在我国基本上实现了设施化和工厂化生产，但工厂化栽培所使用的双孢蘑菇菌种却严重依赖国外进口，因此，我国应加快开展适宜工厂化栽培且具有自主知识产权的优质双孢蘑菇菌种的培育工作。本文介绍了双孢蘑菇的6种育种方法，以期为我国的双孢蘑菇育种工作提供理论依据。

1 自然选种

自然选种[5]也叫选择育种，是一种不断去劣存优的菌种筛选方法，目标是获得有益的突变菌株。1894年，双孢蘑菇纯菌种首次育成[6]。1929年，国外学者公开了利用双孢蘑菇组织和孢子制种的方法，包括双孢蘑菇孢子萌发形成菌丝体并产生子实体的培育过程[7]。索米塞尔菌株（1948，法国）及白色、棕色和奶油色等蘑菇菌株（1950，美国）都是通过人工自然选种获得的[5～9]。20世纪80年代以前，我国缺乏双孢蘑菇种质资源，栽培品种（如S176）主要从国外引进经人工自然选育而成[9]。但是自然选种具有其局限性，因菌株没有基因重组，在遗传上变异性很小，很难获得性状改良明显的变异株。

2 孢子分离育种[10]

Sinden采用多孢筛选法获得双孢蘑菇A6菌株[11]。多孢筛选法的局限性在于菌种在遗传背景上的均一性大于变异性，不能有效组合优势性状，难以获得优良的变异株。相对于多孢筛选法，单孢分离筛选法虽然费时，但获得性状改良明显的双孢蘑菇新菌株的几率更大[12～13]。闽一号菌株就是通过分离孢子获得的菌株，因表现较好而被广泛应用[14]。通过多孢分离和单孢分离选种方法虽然筛选出了许多菌株，但这些菌株存在高产的菌株常常不优质、优质的菌株常常不高产的问题[14]。

3 杂交育种[12～13，15～21]

双孢蘑菇经过减数分裂产生有性孢子，通过有性杂交可获得综合双亲优良性状的新品种[22]。目前，国内外育种工作主要根据双孢蘑菇同核不育菌株配对杂交定向育种的方法进行双孢蘑菇品种改良。20世纪70年代，国外学者利用纯白色和米色蘑菇品种不育单孢子进行杂交配对，以恢复结实性为筛选标记，选育出杂交菌株U1和U3[23]。我国从20世纪80年代初开始开展双孢蘑菇杂交育种工作。福建省农科院食用菌研究所、上海市农科院食用菌研究所等6家单位在国家蘑菇攻关项目的支持下，从1986年开始开展跨地域的技术合作，历时25年，建立了单孢配对杂交、分子标记辅助双孢蘑菇育种、同核体筛选鉴别、杂交异核体快速鉴定等技术体系，用以分析菌株间的定向筛选目标新菌株、预测新菌株特性、跟踪子代遗传与变异、鉴定杂交和亲缘关系、鉴定菌株的基因型、推定同核体不育株[17～21]。1989年，我国利用该方法[17]成功选育出第1个具有自主知识产权的双孢蘑菇杂交品种As2796。廖剑华应用来源于菌株As2796同核不育菌株进行配对回交，筛选出适合工厂化栽培的新菌株W192，该菌株使双孢蘑菇的平均单产提高了20%～25%[24]。

双孢蘑菇同核不育单孢配对杂交育种法着眼于杂交菌株间的性状优势互补，其目的性比较明确，但该方法在双孢蘑菇育种中存在几个问题。（1）双孢蘑菇独特的双孢担子难以获得用于杂交的同核孢子；（2）菌丝体不发生锁状联合现象，难以快速区分异核体与同核体菌丝，且单孢分离萌发率低[5～9，17～24]；（3）尚未发现与重要性状相关的遗传标记，缺乏定向育种的跟踪标记，产生的杂交菌种并不都具备亲本的优良性状[25～26]；（4）单孢分离操作繁琐，染菌率高[27]。

4 原生质体育种

原生质体育种包括原生质体单核化和原生质体融合两项技术。原生质体单核化可以获得食用菌遗传育种单单杂交和单双杂交过程中十分重要的基础材料。单核化杂交育种可极大减少筛选杂交次数、缩短育种周期、拓宽育种范围等[28]。单核杂交技术主要存在同核原生质体的再生率和获得同核体的比例很低等问题。Wessels[29]采用特殊的溶壁酶体系和稳定剂使双孢蘑菇原生质体再生率达到了30%以上。马爱民[19]从不同来源的双孢蘑菇菌株中获得同核原生质体的同核率达到了15%。

原生质体融合[30]是指在促融剂作用下对遗传性状不同的两个原生质体进行融合，借以获得兼有双亲优良遗传性状的稳定的重组子的过程。首先研究双孢蘑菇原生质体的制备与再生、同核体的分离与鉴定等[19]，进而研究同核原生质体亲和性反应及杂交异核体F2代的农艺性状分离与变异规律，建立以菌落形态、菌丝生长速度、羧甲基纤维素酶相对活性以及酯酶同工酶电泳为手段的杂交异核体的鉴定体系[31]。黎雪等利用原生质体融合技术以双孢蘑菇品种浙农1号和As2796为亲本，获得新菌株Z-3和Z-7，产量分别较As2796提高12.5%和5.1%[32]。与常规杂交相比，该项技术主要有以下优势：原生质体融合不受物种属种的限制，可发生在物种内，也可发生在物种之间或属之间；因为没有细胞壁，细胞融合和细胞基因重组的概率较高；对于亲本菌株，无需特殊的遗传标记。但是原生质体融合的融合子筛选较为复杂。目前，原生质体育种技术路线主要有两种，一是利用同核单孢杂交野生菌株与商业菌株选育抗性较强或性状优良的生产品种，二是利用原生质体作为受体细胞，将DNA片段插入到细胞中，转化育种可定向改造蘑菇基因，通过有效的筛选标记方法获得目的菌株。

5 基因工程育种

基因工程育种是一种在分子水平上的育种技术。该技术是通过基因工程的手段对基因组进行改造，主要包括目的基因与载体的构建，原生质体制备、转化或转导或DNA分子杂交技术，目的基因在受体细胞稳定表达并稳定遗传，获得新菌株。该方法于1991年首次被提出[33～34]，并于1996年首次建立了转化体系，为双孢蘑菇的遗传转化工作奠定了基础[35]。研究人员利用该技术成功获得外源基因稳定遗传表达的转基因新菌株，包括应用反义RNA技术抑制酪氨酸酶活性，获得了不易褐变的双孢蘑菇转基因菌株，利用农杆菌介导转化双孢蘑菇子实体等。基因工程的育种方法使得双孢蘑菇外源基因转化效率大幅度提高，极大推进了双孢蘑菇乃至整个食用菌领域的基因工程研究[36～38]。

6 诱变育种

诱变育种就是采用化学方法、物理方法等制造突变，再综合筛选获得高产、优质、适应性强的目的菌株，诱变材料可以为孢子或原生质体。应用该方法育种，菌株的遗传突变几率大大提高。但诱变菌株在经历诱变的过程中其遗传基因也可能改变，且有益突变很少，因此利用诱变获得的食用菌高产菌株很少。在食用菌的诱变育种中常使用60Co-Y射线、紫外线、离子束、超声波、X射线、快中子、激光、亚硝酸、亚硝酸胍、硫酸二已酯、氮芥等，可根据菌种的特点和实验条件选择不同的诱变剂[39～40]。但双孢蘑菇育种很少采用诱变育种法。李前红采用60Co-Y射线诱变处理菌株As2796孢子，结合同工酶标记、RAPD标记、ISSR标记以及出菇实验，获得了3株品质好且产量高的双孢蘑菇菌株[41]。

双孢蘑菇的育种目标主要有：（1）获得适宜不同基质且利用率高、产量高、质量好的菌株；（2）改良双孢蘑菇的抗病基因，提高双孢蘑菇的抗病能力，选育出抗性（抗虫、抗病和耐热等）强的新品种；（3）改良双孢蘑菇褐变基因，延长双孢蘑菇货架期。目前，双孢蘑菇商业菌种主要来源于U系列或AS2796系列的后代，如A15、W192等菌株[14]。双孢蘑菇新品种的获得，需建立在进一步研究遗传背景、确定优良性状、确定有稳定遗传的生物学标记的基础上，从而建立稳定的遗传转化体系。