外部环境条件对香菇原生质体产量与再生率的影响

牟 超

(抚顺市现代农业及扶贫开发促进中心，辽宁 抚顺 113000)

香菇富含多种营养（包括维生素、蛋白质、脂肪酸、氨基酸、矿物质元素），同时具有宜人的香气，食之味道鲜嫩，口感绝佳，食用价值较高。香菇又被称为冬菇或香蕈，在分类学中属于担子菌纲，伞菌目，口蘑科，香菇属，是一种为人们所喜爱的常见食用菌。

中国是香菇消费和生产的大国，并且中国的香菇栽培规模也位列于世界的前端，然而在香菇的育种研究方面却有些许落后。所以，当务之急是香菇新品种研发以及原有品种的改良工作。目前较为常用的育种手段是原生质体技术，这一技术能够在一定程度上有效缩短食用菌的育种周期，但是，此项技术还未在全国范围内进行推广实施，目前由原生质体技术所派生出的育种技术主要有以下4类，原生质体诱变、原生质体转化、原生质体融合、原生质体单核化。相对于其他育种方式而言，原生质体育种具有育种周期短、效率高的特点，同时对于食用菌的品质、产量以及抗性都有显著的提升效果，进而提高香菇的育种水平。这个过程里面原生质体育种的基础是原生质体的制备和再生。所以，本文重点研究外部环境条件对于香菇原生质体产量与再生率的影响，以此作为食用菌类的原生质体育种工作的参照。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试食用菌种： 香菇（Letinula Edodes）辽抚4号编号0912，由抚顺市农业科学研究院提供；母种培养基（克/升）：马铃薯200.0、蔗糖10.0、葡萄糖10.0、蛋白胨2.0、木屑150.0（煎汁过滤）、硫酸镁0.5、磷酸二氢钾1.0、水1000.0、琼脂粉12.0，培养基的酸碱度调整至5.5；再生培养基：与母种相同，外加稳渗剂进行定容。

稳渗剂配置：甘露醇、0.4摩尔/升的硫酸镁、氯化钠、氯化钾，pH=5的蔗糖和葡萄糖液体。其他试验试剂：0.22微米微孔滤膜过滤除菌，该试剂需要现配现用，酶液用对应稳渗剂配制酶浓度（W/V，重量体积比）1.0%的蜗牛酶，纤维素酶与混合酶（蜗牛酶∶纤维素酶=1∶1）。Cellulase（MP Biomedical）及Snailase（Wolsen）等为国产分析纯。

1.2 试验方法

原生质体数量统计：利用血球板进行计数，首先将原生质体稀释至108，涂至平板上，然后按照公式：原生质体产量（个/毫升）=每格平均原生质体数×400×稀释倍数×104进行计算。

原生质体再生率（%）=[(再生平板菌落数-CK板菌落数）×稀释倍数]/（涂布体积×原生质体浓度）×100

方案设计：选取7个外部环境因素，考察这7 个外部环境因素对香菇原生质体的产量以及再生率的具体影响。详情见表1。

表1 单因素试验设计

2 结果与分析

2.1 不同种类裂解酶原生质体产量与再生率的影响

如图1所示，混合酶的酶解效果要比单一酶所产生的酶解效果好一些，混合酶作为酶解介质时，单位时间内原生质体的产量最高能达5.69×108个/毫升，此产量是蜗牛酶作为酶解介质原生质体产量的1.42倍，是纤维素酶作为酶解介质产量的4.15倍；混合酶作为酶解介质时，原生质体再生率是0.91%，蜗牛酶作为酶解介质的原生质体再生率为0.9%，达到了纤维素酶作为酶解介质时原生质体再生率的2.39倍。产生如此大差异的原因是，香菇自身的菌丝细胞壁组成成分比较复杂，因此，需要不同种类的酶共同作用，才能对其产生较好的降解作用。在此组试验中，蜗牛酶是包含了淀粉酶、蛋白酶等20多种不同种类的酶于一体。因此，其酶解效果与混合酶一样能够较好的刺激原生质体的再生，但是纤维素酶成分比较单一，故而对原生质体的酶解效果一般。综上研究，在后续的多因素试验中会优先选择混合酶作为介质。

图1 不同酶种类对原生质体产量与再生率的影响

图2 酶解时间对原生质体产量与再生率的影响

2.2 酶解时间对原生质体产量与再生率的影响

通过图2可以看出，酶解时间在3小时之内时，原生质体再生率与时间呈正相关的关系，随着时间的增加，原生质体的产量也不断增加。之后，原生质体的再生率则会出现下降。在整个酶解过程中原生质体产量从2小时后明显上升，2.5小时后逐渐下降。回归分析后，可知酶解时间为2.82小时，原生质体再生率达到顶点1.7%；酶解时间为3.44小时，原生质体产量达到最高2.27×108个/毫升。

2.3 酶解温度对原生质体产量与再生率的影响

原生质体的产量及再生率受温度影响效果明显，其中30℃是原生质体产量变化的临界点，在这之前原生质体产量醉着温度升高而增加，之后则出现明显的下降。经过回归方程计算可以得出，原生质体再生率在30℃达到最高，为1.08%，原生质体产量在29℃达到最高，为4.06×108个/毫升。分析其他酶解介质可以得出，蜗牛酶的最适酶解温度范围是30～37℃，纤维酶的最适酶解温度为35℃左右，当温度处于最适酶解温度时，其对于菌丝体细胞壁的酶解效果最好。因此，菌丝的细胞壁分解效率较高。而对于混合酶来说，虽然在35℃时酶活性较高，但是较高的温度会扰乱菌丝的内部代谢，影响细胞体内部稳定性，最终影响原生质体的产生。因此，当温度高于30℃，原生质体的再生率和产量均出现了明显下降。

2.4 菌龄对原生质体产量与再生率的影响

试验结果如图3，当菌龄低于4天，随着菌龄的增加，原生质体的产量也会增加，当菌龄高于4天时，随着菌龄的增加，原生质体的再生率逐步降低；当菌龄大于6天时，原生质体再生率急速下降。经过回归方程计算可以得出：原生质体再生率在5.4天时达到最高，约为2.07%；原生质体的产量在4.1天时达到顶点，为2.01×108个/毫升。

2.5 稳渗剂种类对原生质体制备产量与再生率的影响

图4可以看出，当选取甘露醇作为渗稳剂时，原生质体的产量最高但是再生率很低，当使用硫酸镁作为稳渗剂时，原生质体的产量排名第三，仅处于甘露醇和葡萄糖作为渗稳剂之后；硫酸镁的再生率为1.73%，葡萄糖的再生率为1.60%，此再生率仅次于用蔗糖当作稳渗剂的再生平板，蔗糖的再生率为1.94%。由于在制备原生质体时，使用硫酸镁当作稳渗剂，不但能够较好的维持菌丝体细胞膜内外渗透压的稳定性，同时渗稳剂中的Mg2+也能够通过交联羧基和磷脂质实现维持细胞膜稳定的作用。但是Mg2+的供能能力较差，难以维持细胞壁再生所需要的能量，同理单糖也无法实现此项需求。因此，想要实现原生质体再生率最大化，应该选用硫酸镁作为制备渗稳剂，蔗糖作为再生渗稳剂。

2.6 稳渗剂浓度对原生质体产量与再生率的影响

图5可以看出，渗稳剂浓度对于原生质体的产量和再生率都能产生影响，当使用纯净水作为参照时，目标菌丝的原生质体产量是4.2×107个/毫升，原生质体的再生率为0。在此基础上不断加大渗稳剂的浓度，可以看出原生质体的产量和再生率均呈现先增大后减小的变化。通过观察试验曲线可以发现，当渗稳剂浓度低于0.2摩尔/升时，随着浓度增加，原生质体再生率提升明显，此后随着浓度增加原生质体再生率无明显变化；经过回归方程计算：当渗稳剂浓度为0.51摩尔/升时，原生质体产量达到最高1.85×108个/毫升，当稳渗剂的浓度为0.33摩尔/升的时候，原生质体的再生率会达到最大值为1.97%。

2.7 pH对原生质体产量与再生率的影响

图3 菌龄对原生质体产量与再生率的影响

图4 稳渗剂种类对原生质体产量与再生率的影响

图5 稳渗剂浓度对原生质体产量与再生率的影响

图6 pH对原生质体产量与再生率的影响

通过观察下图6，可以发现当渗稳剂pH处于3～4时，原生质体的产量基本上是稳定没有变化，原生质体的再生率为0；当处于4～5时，对于原生质体的产量和再生率都有显著的提升刺激；当处于5～7时，原生质体的产量与再生率都会出现不同程度的下降，回归分析后得出，当pH为5.10时，原生质体的产量可达到最大值，为2.34×108个/毫升，当pH为5.69时，原生质体的再生率可达到最大值，为1.86%。

3 小结与讨论

供给试验使用的几种因素在固定限度之中时，都能够提升原生质体的产量以及再生率，并且具有明显的效果。原生质体的最佳制备条件为，在pH为5.0的条件下，使用0.5摩尔/升硫酸镁作为稳渗剂，在温度达到28℃的时候对5日龄菌丝进行酶解3小时。最佳再生条件为，在pH为5.5的条件下，使用0.5摩尔/升蔗糖作为稳渗剂，在温度达到27.8℃的时候对6.5日龄菌丝进行酶解2.9小时。

酶活和酶解的反应时间将会决定原生质体的产量大小，各种因素对原生质体的产量所造成的影响效果由小到大依次为，渗稳剂、菌龄、酶解时间、酶解温度。同时，酶活性受到酶解液pH和酶解温度的影响，进而影响原生质体产量。当pH为4.5～6.0范围内，则45～55℃为纤维素酶的最适宜温度，30～37℃为蜗牛酶的最适宜温度，酶促反应的快慢与酶活性成正相关关系；同时混合酶的酶解效果要比单一酶效果显著；在单位时间内，混合酶产生的原生质体的数量要大于单一酶所产生的原生质体的数量。

原生质体活性的大小可直接决定原生质体再生率的大小，本次研究中选取的各项因素对于原生质体再生率影响效果由小到大分别是，酶解温度、菌龄、酶解时间、渗稳剂浓度。渗稳剂的浓度过大会导致原生质体失水失活、渗稳剂浓度过小会导致原生质体胀破，这都会影响原生质体的再生率。当反应酶处于其适宜反应条件时，酶解的反应比较快速，因为混合酶系能够对各种各样的底物进行酶解反应，但是，随着酶解时间不断增加，原生质体膜暴露时间过长会导致其细胞壁再生率下降。因此，原生再生率也将会减弱。温度为（25±1）℃时，是香菇菌丝和原生质体的最佳生长温度，过高或者过低均会影响再生率。