香菇YJ-01原生质体制备与再生条件的优化

刘 璐 高 原 杜双田田梦媛 耿 缘

（西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌712100）

我国是香菇生产消费大国，栽培规模居世界前列，但育种研究滞后。曾采用引种、驯化及杂交方法选育得到并推广的“武香一号”、冬菇L26、庆科20、Cr系列、“申香8号”等仍难以满足市场对香菇质量与产量的需求，香菇育种与种质改良工作迫在眉睫[1-3]。原生质体育种可有效缩短育种周期，目前由原生质体育种得到并推广示范栽培的新品种还未见报道，外加香菇菌丝在原生质体制备过程中会出现原生质体单核化现象[4-5]，结合诱变育种、原生质体融合育种可针对性的改良种质[6-7]，显著提高香菇的产量、品质与抗病性[8-17]。原生质体的制备与再生是原生质体育种的基础，研究采用通用旋转设计对香菇原生质体制备的工艺及再生条件进行优化，期望为香菇原生质体育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料①香菇菌株：香菇（Lentinus edodes）菌株，编号YJ-01，由西北农林科技大学生命科学学院提供。②母种培养基（g/L）：木屑150.0（煎汁过滤），马铃薯 200.0，葡萄糖 10.0，蔗糖 10.0，蛋白胨 2.0，KH2PO41.0，MgSO40.5，琼脂粉12.0，H2O 1000.0 mL，（pH5.5）。再生培养基：母种培养基用相应稳渗剂定容。③稳渗剂分别为0.4 mol/L的NaCl、MgSO4、KCl、甘露醇，葡萄糖和蔗糖溶液（pH5.0）。

主要试剂：酶液用对应稳渗剂配制酶浓度（W/V）1.0%的蜗牛酶，纤维素酶与混合酶（蜗牛酶∶纤维素酶=1∶1），0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，现配现用。Cellulase（MP Biomedical）及 Snailase（Wolsen）等 为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 菌丝体培养 菌株活化及扩大培养参考文献[18]。

1.2.2 原生质体制备与纯化 原生质体制备与纯化方法参考文献[19]。

1.2.3 原生质体计数 得到的原生质体用稳渗剂重悬后，血球计数板计数，稀释至108涂布平板。

原生质体产量（个/mL）=每小格平均原生质体数×400×稀释倍数×104

1.2.4 原生质体再生 原生质体再生参考文献[20]。

原生质体再生率（%）=[（再生平板菌落数-CK板菌落数）×稀释倍数]/（涂布体积×原生质体浓度）×100

1.2.5 试验设计 对原生质体产量与再生率从以下7个因素进行研究，试验水平见表1。

表1 单因素试验水平

1.2.6 原生质体制备与再生条件优化 根据单因素试验结果，以原生质体产量与再生率为指标，按通用旋转设计安排试验。

1.3 数据分析统计分析采用DPS（Version 7.05），作图采用Orign 9.0。

2 结果与分析

2.1各单因素对YJ-01原生质体产量与再生率的影响

2.1.1 不同酶种类对YJ-01原生质体产量与再生率的影响 图1显示，混合酶的酶解效果优于单一酶。用混合酶酶解时，原生质体产量（5.69×108个/mL）是纤维素酶的4.15倍，蜗牛酶的1.42倍；用混合酶酶解时原生质体再生率（0.91%）仅次于蜗牛酶（0.90%），是纤维素酶的2.39倍。这是因为香菇菌丝细胞壁成分复杂，单一酶不能较好降解细胞壁从而获得大量的原生质体。而蜗牛酶是含有果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种酶的复合酶，而纤维素酶主要由内切或外切β-葡聚糖酶等组成，因此蜗牛酶酶解细胞壁的效果显著优于纤维素酶，但仍不及混合酶的酶解效果。故在后续的多因素试验中采用混合酶酶系。

图1 不同酶种类对YJ-01原生质体产量与再生率的影响

2.1.2 酶解温度对YJ-01原生质体产量与再生率的影响 图2显示，酶解温度对原生质体的产量及其再生率的影响显著。随着酶解温度的升高，原生质体产量迅速增加，在酶解温度为30℃左右时原生质体产量达到最大值，此后随着酶解温度的进一步升高，原生质体产量急剧下降。从酶解温度在30℃左右时，原生质体的再生率也达到最大值。由回归方程计算得，29℃酶解，原生质体产量最高（4.06×108个/mL）；30℃酶解，原生质体再生率最高（1.08%）。这是由于酶解温度影响了酶活，进而影响了原生质体产量与再生率。蜗牛酶的最适温度为30～37℃，纤维素酶的最适温度在35℃，在适宜温度下酶活高，细胞壁分解速率快。虽然在35℃左右，混合酶能保持较高的活性，但过高的温度会打乱香菇菌丝细胞内部代谢，破坏细胞膜的稳定性，进而导致原生质体细胞壁再生困难，所以温度高于30℃时，原生质体产量与再生率图线均呈现下降的趋势。

2.1.3 酶解时间对原生质体产量与再生率的影响由图3知，酶解时间小于3 h，有利于提高原生质体产量与再生率；酶解时间大于3 h时，原生质体产量与再生率均下降。从2 h开始，原生质体产量随酶解时间延长急剧增加，2.5 h之后便缓慢下降。原生质体再生率在2～4.5 h先增加再减小。经回归方程计算得，酶解时间3.44 h，原生质体产量最高（2.27×108个/mL）；酶解时间2.82 h，原生质体再生率最高（1.70%）。

2.1.4 pH对原生质体产量与再生率的影响 在图4中，当3≤pH≤4时，原生质体产量基本保持不变，再生率为0；4≤pH≤5时，原生质体产量与再生率均急剧增加；5≤pH≤7时，原生质体产量与再生率逐步减小。经回归方程计算，在pH5.10时原生质体产量最高（2.34×108个/mL），pH5.69时原生质体再生率最高（1.86%）。

图2 酶解温度对YJ-01原生质体产量与再生率的影响

图3 酶解时间对YJ-01原生质体产量与再生率的影响

图4 pH对YJ-01原生质体产量与再生率的影响

图5 菌龄对YJ-01原生质体产量与再生率的影响

由于pH≤5.0时，再生培养基凝固状态差，无法倒置培养，也无法挑取再生菌落进行下一步试验，故根据回归曲线确定原生质体制备过程中稳渗剂pH5.0，原生质体再生过程中再生培养基的pH5.5。

2.1.5 菌龄对原生质体产量与再生率的影响 图5显示，当菌龄小于4 d时，原生质体产量随菌龄延长而增加；菌龄大于4 d时，原生质体产量逐渐降低。当菌龄小于6 d时，原生质体再生率随菌龄延长而增加，当菌龄大于6 d时，原生质体再生率急剧下降。6日龄菌丝与7日龄菌丝的原生质体产量相近，再生率相差大。经回归方程计算可知，菌龄4.1 d时原生质体产量最高（2.01×108个/mL），菌龄5.4 d时原生质体再生率最高（2.07%）。

2.1.6 不同稳渗剂对原生质体制备产量与再生率的影响 由图6可知，以甘露醇作为稳渗剂，原生质体产量最高但再生率低；以MgSO4做为稳渗剂，原生质体产量（2.74×108个/mL），仅次于甘露醇和葡萄糖，再生率分别为1.73%（MgSO4）和1.60%（葡萄糖），仅次于以蔗糖为稳渗剂的再生平板（1.94%）。这是因为在制备原生质体时，以MgSO4作为稳渗剂，不仅可以维持细胞膜内外的渗透压平衡，同时Mg2+可以与羧基及磷脂质交联，稳定细胞膜。然而在原生质体再生的过程中，Mg2+等无机盐离子不足以为细胞提供再生细胞壁所需的能量，同时单糖无法满足细胞壁再生的物质需求。故以最大原生质体再生率为目标，确定以MgSO4做制备稳渗剂，以蔗糖做再生稳渗剂。

图6 稳渗剂种类对YJ-01原生质体产量与再生率的影响

2.1.7 稳渗剂浓度对原生质体产量与再生率的影响 由图7可知，适当浓度的稳渗剂有利于提高原生质体产量与再生率。以纯水为稳渗剂作为对照组，此时原生质体产量低（4.2×107个/mL），再生率为0。随稳渗剂浓度逐渐提高，原生质体产量与再生率均呈现先增加再减小的趋势。试验结果显示，低浓度稳渗剂（0～0.2 mol/L）对原生质体再生率有显著提高作用，0.2～0.8 mol/L对再生率影响不显著，再生率在缓慢升高至1.88%后（对应稳渗剂浓度0.6mol/L）便呈缓慢下降趋势。由回归方程计算得，稳渗剂浓度0.51 mol/L时原生质体产量有最大值（1.85×108个/mL），稳渗剂浓度0.34 mol/L时，原生质体再生率有最大值（1.97%）。

2.2 原生质体制备及再生条件优化

2.2.1 多因素试验方案确立 为了优化原生质体的制备条件与再生条件，根据2.1中结果以原生质体产量和再生率为指标，兼顾下一步试验的实施性，最终确定以混合酶（纤维素酶∶蜗牛酶体积比1∶1）作为酶系，选择pH5.0的MgSO4为原生质体制备稳渗剂，pH5.5的蔗糖作为原生质体再生稳渗剂。对另外4个因素酶解时间（X1），酶解温度（X2），菌龄（X3）和稳渗剂浓度（X4）按四因素二次通用旋转设计（1/2实施）安排试验，试验因素及水平编码见表2。

2.2.2 原生质体制备数学模型的建立与检验 依据表2实施试验，结果见表3，方差分析见表4。经计算得原生质体产量（Y）与各因素（Xi）水平的函数关系：

表2 试验因素及水平编码表

表3 原生质体产量试验结果

表4 原生质体产量方差分析表

由表4知：对回归方程（1）进行失拟性检验，F失拟=4.62670＜F0.05（5，3）=9.013，可知不失拟。F回归=5.76012＞F0.05（11，8）=3.313，P=0.0047＜0.05，模型符合客观实际。且，达极显著水平，X2、达显著水平。剔除方程（1）在α=0.10条件下不显著项后得：

2.2.3 单因素对原生质体产量的影响

对方程（1）降维得：

图7 稳渗剂浓度对YJ-01原生质体产量与再生率的影响

由方程（3）-（6）得图8。

由方程（1）知，各因素在试验范围内对YJ-01原生质体产量影响作用大小依次为：X2＞X1＞X3＞X4。由图8曲线知，随酶解时间，酶解温度，稳渗剂浓度以及菌龄的增加，原生质体产量呈现先增加再减小的趋势，各供试因素在试验范围内均有最大值。

对方程（3）-（6）求极值得：

经计算得：

X1max=0.27；X2max=-0.85；X3max=0.075；X4max=0.01

经转化公式计算得原生质体制备条件：酶解时间（x1）=3.2 h，酶解温度（x2）=27.9℃，菌龄（x3）=5.1 d，MgSO4稳渗剂（x4）=0.5mol/L。即：在pH=5.0，以0.5mol/L MgSO4做稳渗剂，对5日龄菌丝在28℃酶解3 h，最适原生质体制备（原生质体产量2.72×108个/mL）。

图8 各编码水平对香菇原生质体产量的影响

2.2.4 原生质体再生数学模型建立与检验 试验结果见表5，方差分析见表6。

经计算得YJ-01原生质体再生率与各试验因素的回归方程为：

由方程（7）知，各因素对原生质体再生率的影响效果依次为：X4＞X1＞X3＞X2。对结果进行方差分析，见表6：

依表6对回归方程（7）进行失拟性检验与拟合分析，F失拟=3.65295＜F0.05（5，3）=9.013，不失拟。F回归=6.03451＞F0.0（511，8）=3.313，P=0.0039＜0.05，模型符合客观实际。且，X1、X3、X4、、、X1X3与 X1X4达到显著水平。剔除方程（7）在α=0.10条件下不显著项后得：

表5 原生质体再生率试验结果

表6 原生质体再生率方差分析表

由方程（9）-（12）得图9。

对方程（9）-（12）求极值得：

解得：

图9 各编码水平对香菇原生质体再生率的影响

X1max=-0.35；X2max=-0.37；X3max=1.94；X4max=-0.56

经转化公式计算得：x1=2.8 h，x2=29.1℃，x3=7.3 d，x4=0.43 mol/L。即：当无交互作用时，以0.45 mol/L蔗糖做再生平板的稳渗剂，对7日龄菌丝在29℃酶解3 h，最适原生质体再生（再生率1.36%）。

2.2.6 交互作用对原生质体再生的影响

2.2.6.1 X1（酶解时间）与X3（菌龄）对香菇原生质体再生率的影响

由表6可见，在0.1显著水平上，X1X3与X1X4两个交互项满足条件。故，X1和X3、X1和X4均存在显著的交互作用。

令X2=0，X4=0，将方程（7）降维后得：

由方程（13）得图10。

由图10可知，Y（原生质体的再生率）在供试范围内有最大值，当X1一定时，Y随X3增加呈先增加再减小的趋势；当X3一定时，Y均随X1增加呈先增加再减小的趋势。

2.2.6.2 X1（酶解时间）与X4（稳渗剂浓度）对香菇原生质体再生率的影响

令X2=0，X3=0，方程（7）降维得：

由方程（14）得图11。由图11可知，Y（原生质体的再生率）在供试范围内有最大值，当X1一定时，Y随X4增加呈先增加再减小的趋势；当X4一定时，Y均随X1增加呈先增加再减小的趋势。

图10 X1与X3的交互作用对YJ-01原生质体再生的影响

图11 X1与X4的交互作用对YJ-01原生质体再生的影响

2.2.6.3 模型优化 对方程（7）求极值。

对其各变量求一阶偏导并另其为零，求得模型的极值点：

解方程组得：

X1=-0.24；X2=-0.90；X3=1.23；X4=-0.38

带入转化公式计算得：x1=2.9 h，x2=27.8℃，x3=6.5 d，x4=0.5 mol/L。即：以0.5 mol/L蔗糖做稳渗剂，对6.5日龄菌丝在27.8℃酶解2.9 h，原生质体有最大再生率（1.39%）。

2.2.6.4 验证试验 在以优化得到的最优再生条件下，进行验证试验，测得原生质体产量分别为2.32×108个/mL，1.79×108个/mL，1.54×108个/mL。原生质体再生率再生率分别为1.48%，1.06%，1.88%。与理论值相近，基本符合预测值。证明该条件具有科学性与稳定性。

3 小结与讨论

通过以上分析可得如下结论：

（1）供试4种因素在一定范围内，均可显著提高YJ-01原生质体产量与再生率。YJ-01原生质体最优制备条件为：在pH为5.0条件下，以0.5 mol/L MgSO4做稳渗剂，对5日龄菌丝在28℃酶解3 h。最优再生条件为：在pH为5.5条件下，以0.5 mol/L蔗糖做稳渗剂，对6.5日龄菌丝在27.8℃酶解2.9 h。

（2）原生质体产量由酶活与酶解反应时间决定，各因素对原生质体产量的影响作用依次为：酶解温度＞酶解时间＞菌龄＞稳渗剂浓度。酶解温度和酶解液pH通过影响酶活来影响原生质体产量。在pH4.5～6.0范围内，纤维素酶最适温度为45～55℃，蜗牛酶最适温度为30～37℃，酶活越高，酶促反应越快，相同时间内的原生质体产量越高。稳渗剂浓度是通过影响细胞内外渗透平衡而影响原生质体的产量，当稳渗剂浓度过低时，原生质体吸水膨胀甚至胀破；当稳渗剂浓度过高时，原生质体失水皱缩。酶种类和酶解时间通过控制酶解反应来影响原生质体产量，混合酶可针对不同底物进行反应，因而酶解效果优于单一酶，相同酶解时间内产生原生质体数量多于单一酶。

（3）原生质体再生率由原生质体活性决定，各因素对原生质体再生率的影响作用依次为：稳渗剂浓度＞酶解时间＞菌龄＞酶解温度。原生质体再生过程中，当稳渗剂浓度过低或过高会导致原生质体严重吸水膨胀或皱缩，此时原生质体活性降低，细胞壁再生性能降低，再生率也随之降低。在酶的最适反应条件范围内，酶解反应较快，混合酶系可针对不同底物进行酶解，酶解时间越长，原生质体暴露在酶液中的时间越久，原生质膜损伤也相对变大，原生质体再生细胞壁的性能减弱，再生率降低。加上香菇菌丝与原生质体最适生长温度为（25±1）℃，过高的酶解温度虽然会提高酶促反应速率，但会降低原生质体活性，进而降低影响原生质体再生率。原生质体再生率与菌龄有关可能是因为当菌丝过于幼嫩时，酶解后原生质体不稳定，再生困难，当菌龄过长时，菌丝细胞壁加厚，次生物质增多，再生率下降。

（4）试验利用二次通用旋转组合设计方法建立了原生质体制备与再生的数学模型，并对模型优化，得到原生质体制备再生的较优条件，且验证试验结果接近预测值。试验所得结果，与邢振楠的研究结果[21（]酶解温度30℃，p H=5.5时原生质体产量最佳）接近，但与王镨的研究结果[22（]34℃酶解时原生质体产量最高）、李蕤的研究结果[23（]菌龄6 d，酶解时间3 h，酶解温度34℃，渗透压稳定剂0.6 mol/L甘露醇最适于原生质体制备）、廖汉泉的研究结果[24（]菌龄5～6 d，以0.8 mol/L甘露醇作为稳渗剂，用1.5%溶壁酶液酶解1.5～2 h，所得原生质体的产量高达4×107个/mL，此时再生率也较高）存在差异，这可能与菌株及基础培养基不同有关。

▲更正 本刊2016年第6期第49页“食用菌发酵罐制种技术”（作者姜固胜、张娣、杜萍、王金贺）的基金项目是黑龙江省教育科学规划课题（ZJD1215012）。由于作者投稿时未注明，应作者要求本刊现更正说明。