动物肝脏移植模型的应用研究进展

梁立洲，文张，徐邦浩，郭雅，彭民浩

(广西医科大学第一附属医院，南宁 530021)

1963年，Starzl等[1]施行了首例人体肝脏移植手术。历经50多年的发展，肝脏移植已经成为治疗终末期肝病最有效的方法，但人体肝脏移植一直面临着供体短缺、术后并发症较多和生存率较低等方面的问题，这也导致相关人体研究受到诸多限制。动物肝脏移植模型在肝脏移植研究的发展过程中发挥了关键作用，如何更好地模拟人体肝脏移植的过程并研究其机制，是肝脏移植相关研究的重要内容。现就近年来猪、犬、猴、大鼠和小鼠等动物肝脏移植模型的应用研究进展综述如下。

1 猪肝脏移植模型的应用

猪和人在解剖和生理方面有很多相似之处，已经成为重要的肝脏移植实验动物[2]。猪肝脏移植模型主要用于供肝保存、缺血再灌注损伤等方面的研究。

1.1 用于供肝保存的研究 机械灌注已经在肾移植领域广泛应用，并取得显著的临床效果，但在肝脏移植方面尚处于临床实验阶段。机械灌注可分为低温机械灌注(HMP，0～12 ℃)、亚低温机械灌注(SMP，25～34 ℃)和常温机械灌注(NMP，35～38 ℃)。使用常温机械灌注长期保存的器官不仅可以在移植前评估器官的活力，还可以提供进一步修复器官的手段。猪肝脏常温机械灌注保存的安全移植时间为20 h。Thomas等[3]进一步将安全移植的时间延长，将猪肝脏常温机械灌注保存48 h后再进行移植，发现所有的移植物均显示出良好的移植物功能。静态冷保存是离体肝脏保存的金标准，Zhang等[4]比较了常温机械灌注和静态冷保存在预防猪小体积肝脏移植期间缺血再灌注损伤中的作用，发现常温机械灌注保存优于静态冷保存。在正常离体肝灌注期间，使用血管扩张剂可有效避免肝动脉痉挛。Echeverri等[5]将心脏不停跳的猪供体肝脏机械灌注3 h后移植于受体猪，发现在正常离体肝脏机械灌注中使用BQ123(内皮素1拮抗剂)、依前列醇(前列环素类似物)和维拉帕米(钙通道拮抗剂)都是安全的，使用BQ123和维拉帕米的肝脏具有更高的肝动脉流量和更少的肝细胞损伤，可以有效减轻肝动脉痉挛。

1.2 用于缺血再灌注损伤的研究 缺血再灌注损伤是移植过程中移植物损伤的重要原因，研究缺血再灌注损伤对于进一步改善肝脏移植术后结局至关重要。Maione等[6]验证了猪分离肝脏为研究早期缺血再灌注损伤提供可重现模型的可靠性，有助于缺血再灌注损伤的体外研究。促红细胞生成素(EPO)可以通过EPOR2/βcR2受体复合物(促红细胞生成素受体EPOR和一个共同受体βcR形成的异二聚体受体复合物)诱导抗炎和抗凋亡作用。Kebschull等[7]研究发现，由于EPOR2/βcR2受体复合物对EPO的亲和力非常低，当EPO剂量低于刺激该受体复合物的水平时，在猪肝脏移植模型中可以产生细胞保护作用，提示可采用供体和受体的低剂量EPO治疗以减轻移植肝脏的缺血再灌注损伤。

1.3 用于改善肝功能的药物试验 熊果酸(UA)具有抗氧化、抗感染、抗炎、抗肿瘤等作用，Zhou等[8]探讨了UA对心脏死亡后捐献(DCD)肝脏在移植后功能的影响并评估其机制，认为UA可能通过抑制细胞凋亡和PERK-CHOP途径改善DCD肝脏在移植后的功能。肝脏移植术后缺血性胆道病变很常见，是导致DCD肝脏丧失功能的重要原因。Hessheimer等[9]评估了给予肝素改善DCD肝脏移植质量和避免潜在缺血性胆道病变的效果，结果表明，在心脏停搏之前给予供体肝素有助于改善DCD肝脏在移植后的缺血性胆道病变。

1.4 用于早期同种异体移植物功能障碍(EAD)的研究 肝脏移植术后EAD与移植物存活率低下有关。然而，由于缺乏特异性的标志物，对EAD的准确预测仍然很困难。肝细胞来源的微小RNA(miRNA)具有作为肝细胞损伤的敏感、稳定和特异性生物标志物的潜力。Selten等[10]的研究发现，移植物保存液中的microRNA-122水平与DCD、EAD及肝脏移植后早期移植物损伤均有关。由于供体器官同时受到脑死亡和热缺血性损伤的影响，在脑死亡后心脏死亡(DBCD)的器官移植中常会出现不良移植结果。Cheukfai等[11]用3组猪器官供体模型进行研究，结果发现，DBCD组猪肝脏移植物中的miR-146b表达水平相比于脑死亡后组和心脏死亡后组显著增加，这一研究首次揭示了DBCD肝脏移植物的miRNA特征，提示人类miR-146b-5p(与猪miR-146b同源)可能对监测肝脏移植物功能和预测移植结果具有重要的临床意义。

2 犬肝脏移植模型的应用

犬肝胆系统的解剖及生理生化特征与人类非常相似，其体形大小、肝脏体积也同儿童非常接近，是肝脏移植研究的理想动物模型。1955年Welch首先施行狗的同种异体异位肝脏移植，1959年Moore首次施行狗的同种异体原位肝脏移植，目的是摸索和建立一整套切实可行的手术方法和技术，以期应用于人类临床研究。犬肝脏移植模型主要用于供肝保存、手术方法等方面的研究。

2.1 用于供肝保存的研究 Zhao等[12]将实验犬随机分为供体组(A组)、静态冷保存组(B组)和低温机械灌注组(C组)，从A组取出的肝脏在静态冷保存后移植到B组，从B组取出的肝脏在低温机械灌注后移植到C组，并从B组和C组中随机选择20只肝脏移植成功的犬进行比较，结果表明，低温机械灌注可显著降低氧化应激因子及炎症因子水平，供肝保存效果优于静态冷保存。

2.2 用于门静脉动脉化术的研究 门静脉动脉化术是一种补救动脉或门静脉血流不足的手术，主要应用于肝脏移植及肝胆胰外科手术中，可作为移植或再移植的桥接程序。Ashour等[13]将24只成年犬分成3组，G1组接受65%肝切除术，G2组接受65%肝切除术和肝动脉结扎术，G3组接受65%肝切除术和部分门静脉动脉化术，结果发现，术后1周G3组肝脏组织再生率显著增加。

3 猴肝脏移植模型的应用

灵长类动物中肝脏移植模型相对较少。恒河猴在基因和表型水平上与人类非常相似，是一种理想的肾、心脏和胰岛移植的临床前模型，用其建立肝脏移植模型也可以获得更接近临床的观察数据。猴肝脏移植模型主要用于免疫排斥反应、手术方法等方面的研究。

3.1 用于免疫排斥反应的研究 正常肝脏中有大量的CD4+调节性T细胞、CD8+T细胞、CD28-T细胞和骨髓来源的抑制细胞(MDSC)，它们是免疫抑制细胞，水平比在淋巴结或外周血中高得多。Kim等[14]对5只正常供体恒河猴肝脏进行了5次同种异体ABO血型相容的原位肝脏移植，并收集淋巴结、脾脏、血液和受体肝脏，分析外周血单个核细胞和次级淋巴器官以及正常恒河猴肝脏的免疫细胞群，并将它们与免疫抑制停止后的肝脏移植受体进行比较，结果显示，在受体恒河猴肝脏免疫排斥反应中，CD4+调节性T细胞、CD8+T细胞、CD28-T细胞和MDSC均显著减少，提示可以通过恒河猴肝脏移植模型进一步研究肝脏移植的免疫耐受机制。

3.2 用于肝脏移植手术方法的研究 Kim等[15]设计了一种同种异体ABO血型相容的恒河猴原位肝脏移植模型，采用几乎与人类常规肝脏移植相同的手术程序进行肝脏移植，结果显示，对于灵长类动物模型中的同种异体原位肝脏移植，可以采用与人类传统死亡供体肝脏移植几乎相同的方法进行肝脏移植。

4 大鼠肝脏移植模型的应用

1973年，Lee等[16]首次建立并报道了大鼠原位肝脏移植模型，这是一个复杂的显微外科手术模型，可以用于研究供肝保存、移植物状态、缺血再灌注损伤等方面的移植问题。

4.1 用于供肝保存的研究 Rigo等[17]通过使用常温机械灌注和人类肝脏干细胞衍生的细胞外囊泡(HLSC-EV)的组合来探索对分离的大鼠肝脏进行药理干预的可行性，证明在大鼠肝脏移植模型中HLSC-EV治疗是可行的，有效减少了常温机械灌注期间的肝脏损伤。低温机械灌注是研究最早、最多也是使用最广泛的机械灌注类型，然而目前还没有适用于大鼠肝脏体积的便携式低温机械灌注系统。LifePort是一款在肾移植领域广泛应用的机械灌注仪器，Zeng等[18]开发了一种使用LifePort保存大鼠肝脏的新型改良低温机械灌注系统，可更为方便地进行大鼠供肝保存研究。

4.2 用于移植物状态的研究 OX40/OX40L是移植物免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子，转染OX40Ig基因的腺病毒可用于大鼠肝脏移植长期存活影响因素及其机制的研究。Chen等[19]发现，OX40Ig基因在大鼠肝脏移植后产生了免疫抑制作用，这种免疫抑制作用与IL-2减少相关，并且可以通过加入具有抗原特异性的IL-2来逆转。移植前的肝脏和肾脏能量状况与移植物存活率相关。然而，脑死亡对器官特异性能量状态的影响在很大程度上是未知的。Van等[20]研究了脑死亡后肝脏和肾脏的代谢、灌注、耗氧量和线粒体功能，结果显示，在脑死亡期间，肝脏为适应增加的代谢需求，会增强功能性线粒体的有氧代谢，这一研究结果可用于器官特异性评估和优化移植前移植物质量、优化肝脏代谢状况。

4.3 用于缺血再灌注损伤的研究 Liu等[21]用辛伐他汀预处理死亡后供体肝脏，发现辛伐他汀可通过KLF2依赖性机制改善死亡后供体肝脏的功能恢复。缺血再灌注损伤早期病理生理变化的特征是过度的炎症反应，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是调节炎症反应的重要代谢中间体。Tang等[22]发现，SAM可以通过抑制氧化应激、炎性反应和肝脏移植术后胆管上皮细胞的凋亡来减轻胆管热缺血再灌注损伤。TLR4—NF-κB信号传导在防止肝脏缺血再灌注损伤中至关重要，肝X受体(LXR)活化可以拮抗TLR4-NF-κB信号传导。Cheng等[23]研究发现，LXR激动剂GW3965能够抑制肝脏移植期间的TLR4—NF-κB信号传导，并减轻肝脏缺血再灌注损伤。

5 小鼠肝脏移植模型的应用

自1991年Qian等首次描述小鼠肝脏移植模型以来，现阶段已经积累了大量关于小鼠肝脏免疫生理、肝脏损伤、肝脏移植免疫耐受-排斥平衡等方面机制的研究。小鼠肝脏移植与大物种(如大鼠或猪)肝脏移植相比具有独特的优势，小鼠的基因组有显著的特征，而且还有很多可用的转基因小鼠和研究试剂。小鼠肝脏移植模型主要用于移植自噬、移植术后代谢等方面的研究。

5.1 用于移植自噬的研究 移植自噬对于抵抗肝脏缺血再灌注损伤是必不可少的，但其在临床原位肝脏移植中的意义仍不清楚。Kojiro等[24]检测了小鼠原位肝脏移植模型中血红素氧合酶-1(HO-1)介导的自噬诱导作用，证实了HO-1与肝细胞保护的临床相关性，确定了SIRT1(一种关键的自噬调节剂)介导的自噬途径是原位肝脏移植缺血再灌注损伤应激中的基本调节因子。

5.2 用于Wilson病治疗的研究 肝豆状核变性由Wilson在1912年首先描述，故又称为Wilson病，为常染色体隐性遗传性铜代谢障碍，其致病基因ATP7B位于13号染色体，在肝、肾和胎盘中高表达。当螯合疗法失败时，肝脏移植是治疗Wilson病的唯一选择。Cheng等[25]使用8周龄和20周龄的ATP7B基因敲除小鼠进行辅助部分原位肝脏移植，术后小鼠肝脏和血清铜含量减少，提示早期进行辅助部分原位肝脏移植可延缓小鼠Wilson病的进展。

5.3 用于胆红素代谢的研究 活体肝脏移植术后，血清胆红素水平升高通常表明肝细胞的数量不足以将胆红素代谢成胆绿素，胆红素水平的恢复是活体肝脏移植后肝细胞再生的重要标志。Kao等[26]将野生型小鼠与雌激素受体α基因敲除小鼠进行了转录组比较，证明在分子水平上，雌二醇/雌激素受体α信号通路有利于移植肝脏的胆红素代谢功能恢复，这一结果有助于理解在女性肝脏移植患者中胆红素代谢有所改善，以及肝功能恢复的时间短于男性的原因。

5.4 用于缺血再灌注损伤的研究 死亡受体是缺血再灌注损伤的重要介质，特别是死亡受体CD95信号传导途径及其相应的配体CD95L。Al-Saeedi等[27]的研究表明，CD95L阻断剂CD95Fc可有效保护小鼠免于肝脏缺血再灌注损伤引起的肝衰竭，CD95Fc可能成为肝切除、移植手术和急性肝衰竭的新型治疗药物。过氧化物毒素(Prxs)属于巯基依赖性过氧化物酶的超家族，可以去除活性氧簇和其他氧化应激产物，是炎症性肝病和缺血再灌注损伤中人体必需的介质和生物标志物。Lu等[28]的研究结果表明，Prxs可以用作生物标志物来评估缺血再灌注损伤，并预测肝脏移植中的移植物存活率。

总之，近年来大型或小型实验动物肝脏移植模型已经在诸如术前供肝保存、术中方法改进、术后移植物状态监测等诸多方面取得了很大的进展。部分研究已经可以开展相关临床实验进行验证，例如移植物保存液中的microRNA-122水平和猪miR-146b的发现有利于寻找术后EAD更为敏感的标志物，而应用于临床正是动物肝脏移植模型研究的最终目的。当前各种肝脏移植动物模型总有一些局限性而不能完全模拟人类肝脏移植的临床状态，因此正确选择并利用各种动物的特点，进一步研究各种肝脏移植动物模型在肝脏移植各个阶段的技术、方法及相关机制，是肝脏移植术发展的基础和发展方向。相信在不久的将来，供体短缺、术后并发症和生存率较低等方面的相关问题也会在肝脏移植动物模型的深入研究中得到解决。