LCL161联合多西他赛对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖、凋亡的影响及机制

刘永红，许培权，王康伟，汪进城，金功圣

(1 蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠233000；2 浙江省杭州市余杭区第一人民医院；3 蚌埠医学院第二附属医院)

乳腺癌是全世界范围内女性发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一，外科治疗后辅助化疗为目前主要的治疗方式[1]。多西他赛、阿霉素、环磷酰胺、顺铂等作为一线化疗药物在多数乳腺癌治疗中有效，然而其不良反应较多[2]。细胞凋亡抑制蛋白(IAPs)是一类在程序性细胞凋亡进程中发挥重要作用的蛋白质，可以抑制细胞凋亡并促进细胞周期进程。研究[3]显示，IAPs在多种肿瘤细胞中高表达，并且与肿瘤恶性进展、远处转移和肿瘤的治疗抗性有关。研究[4]表明，通过siRNA干扰或反义寡核苷酸下调IAPs表达可以诱导肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞对放化疗和结合死亡受体更加敏感，使得IAPs成为肿瘤治疗的重要靶标。研究[5]显示，第二线粒体抑制剂的拮抗剂(Smac)模拟物LCL161，可以通过降解IAPs进而抑制肿瘤的进展，还可通过激活凋亡起始蛋白半胱天冬酶-8(Caspase-8)诱导肿瘤细胞凋亡。研究[6]显示，LCL161对白血病、肝细胞肝癌、多发性骨髓瘤等有明显的增殖抑制、促进细胞凋亡的作用，在联合放疗、化疗或靶向治疗中能发挥协同作用并提高治疗效果，且具有毒性低、耐受性好等特点。然而，有关LCL161在乳腺癌治疗方面的研究鲜有报道。2018年2月10日～2018年10月20日，本研究观察了LCL161联合多西他赛对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖及凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人乳腺癌MCF-7细胞株购自中国科学院细胞库。LCL161和多西他赛购自美国MCE公司。RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自德国pan公司；cIAP1、cIAP2、RIP1抗体购自美国CST公司；β-Actin抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG、CCK-8试剂盒、ATP检测试剂盒及AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自Biosharp公司。

1.2 LCL161给药浓度的测算及细胞分组 ①LCL161给药浓度的测算。取对数生长期的MCF-7细胞按5 000个/孔接种于96孔板中，每孔加入100 μL培养液，待细胞贴壁生长后，弃去培养液，加入100 μL含有不同浓度的LCL161(1、2、3、4、5 μmol/L)培养液，记为实验组。以只加入培养液，不加入MCF-7细胞和LCL161的组为空白组；以加入培养液和MCF-7细胞，不加入LCL161的组为对照组。实验组和对照组培养24 h后加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养箱中继续孵育1 h，振荡10 min充分溶解结晶物，用多功能酶标仪在450 nm波长处检测各组OD值，计算各组细胞存活率。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。结果显示，实验组加入1、2、3、4、5 μmol/L LCL161的细胞存活率分别为93.52%±3.26%、85.33%±2.19%、73.34%±2.87%、64.78%±3.19%、64.82%±1.48%。选取对细胞增殖无明显抑制作用、细胞毒性较小的实验组用于后续实验，即LCL161的给药浓度为2 μmol/L。②细胞分组。将对数生长期的MCF-7细胞分为4组： LCL161组、多西他赛组、LCL161联用多西他赛组、对照组。各组细胞按5 000个/孔接种于96孔板中，每孔加入100 μL培养液，待细胞贴壁生长后弃去培养液，各组加入相应药物继续培养24 h。LCL161组加入2 μmol/L的LCL161，多西他赛组加入0.6 mg/L的多西他赛，LCL161联用多西他赛组加入0.6 mg/L的多西他赛和2 μmol/L的LCL161，对照组加入不含药物的培养液。

1.3 各组细胞存活率测算 采用CCK-8法。各组细胞避光条件下加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养箱中继续孵育1 h，振荡10 min充分溶解结晶物，用多功能酶标仪在450 nm波长处检测各孔的OD值，计算细胞存活率。细胞存活率=[实验组OD值-空白组OD值]/[对照组OD值-空白组OD值]×100%。

1.4 各组细胞集落克隆能力检测 采用细胞集落克隆实验。取各组细胞按7 000个/孔接种于6孔板，置于培养箱中培养5 d，细胞生长至形成肉眼可见菌落时停止培养，PBS清洗3遍，每次2 min，放置于空气中干燥，用4%多聚甲醇固定细胞，0.5%结晶紫染色液染色30 min，使用双蒸水清洗6孔板底部，吸弃双蒸水后室温放置干燥，显微镜下计数各组细胞集落数目。

1.5 各组细胞晚期凋亡情况观察 采用Hoechst33258染色法。取各组细胞于6孔板中继续培养24 h，吸弃培养液，PBS清洗1次，10%甲醛固定，吸弃固定液，PBS清洗3次，每次5 min，加入10 μg/mL的Hoechst33258染色液1 mL避光染色15 min，PBS清洗3次，每次5 min，吸弃PBS，倒置荧光显微镜下观察。

1.6 各组细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。取各组细胞用不含EDTA的胰酶消化，用15 mL离心管收集细胞，2 000 r/min离心5 min，倒去上层液体后加入1 mL PBS重悬，加入500 μL Binding Buffer混匀细胞后，分别加入PI及Annexin V-FITC各5 μL，室温避光孵育20 min后流式细胞仪检测，Flowjo软件计算各组细胞凋亡率。

1.7 各组细胞凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2及程序性坏死蛋白RIP1检测 采用Western blotting法。取各组细胞培养于100 mm培养皿中，加入100 μL预冷的RIPA蛋白裂解液，置于冰上裂解1 h，4 ℃低温离心机中12 000 rpm离心20 min，吸取上清液转移至EP管中，使用BCA蛋白定量法测各组的蛋白浓度；根据各组的蛋白浓度加入相应体积的蛋白上清液，SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜，封闭2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，于抗体孵育盒中加对应一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加对应二抗，室温下孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，按照ECL发光试剂盒说明书进行检测，Bio-Rad凝胶成像系统获取图像，使用Image J软件扫描各组灰度值，以灰度值表示各组cIAP1、cIAP2、RIP1蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞存活率比较 LCL161组、多西他赛组、LCL161联用多西他赛组、对照组的细胞存活率分别为86.84%±3.83%、81.29%±6.71%、46.91%±4.76%和92.77%±2.18%，LCL161组与对照组相比，P>0.05；其余组间两两相比，P均<0.05。

2.2 各组细胞集落数目比较 LCL161组、多西他赛组、LCL161联用多西他赛组、对照组的集落数目分别为(117±14)、(95±9)、(61±12)、(132±7)个，LCL161组与对照组相比，P>0.05；其余组间两两相比，P均<0.05。

2.3 各组细胞晚期凋亡情况比较 LCL161组细胞膜通透性增加，染色质固缩，部分细胞发生了核碎裂；多西他赛组和对照组的细胞核均匀淡染，细胞核形态呈椭圆形，细胞膜相对完整；LCL161联用多西他赛组细胞数量明显减少，细胞核碎裂，部分发生了核解体。

2.4 各组细胞凋亡率比较 LCL161组、多西他赛组、LCL161联用多西他赛组、对照组细胞凋亡率分别为15.16%±2.26%、21.42%±1.17%、34.38%±3.27%、5.18%±0.89%，LCL161组与对照组相比，P>0.05；其余组间两两相比，P均<0.05。

2.5 各组细胞cIAP1、cIAP2、RIP1蛋白的相对表达量比较 LCL161组、多西他赛组、LCL161联用多西他赛组、对照组cIAP1蛋白的相对表达量分别为0.41±0.09、0.29±0.11、0.11±0.04、0.62±0.17，LCL161组与对照组相比，P>0.05；其余组间两两相比，P均<0.05。LCL161组、多西他赛组、LCL161联用多西他赛组、对照组cIAP2蛋白的相对表达量分别为0.86±0.11、0.77±0.15、0.51±0.12、0.98±0.01，LCL161组与对照组相比，P>0.05；其余组间两两相比，P均<0.05。LCL161组、多西他赛组、LCL161联用多西他赛组、对照组RIP1蛋白的相对表达量分别为1.97±0.22、1.84±0.19、3.17±0.26、1.00±0.07，LCL161组与多西他赛组相比，P>0.05；其余组间两两相比，P均<0.05。

3 讨论

研究[7]显示，IAPs在肿瘤的调控机制中发挥着重要作用，在许多肿瘤组织中高表达，其表达水平与预后密切相关。研究[6]表明，Smac可通过降解IAPs而对肿瘤发挥抑制作用。研究[8,9]显示，Smac模拟物还可以通过激活凋亡起始蛋白Caspase-8，继而激活TNF-α依赖的细胞凋亡。本研究首先通过设置不同浓度的LCL161处理MCF-7细胞，选取对细胞增殖无明显抑制作用、细胞毒性较小的LCL161剂量用于后续实验。我们对加入LCL161和多西他赛的各组细胞存活率、细胞集落克隆能力进行了检测，结果显示，多西他赛可显著升高细胞增殖抑制能力，而当LCL161与多西他赛联用时，细胞的增殖抑制能力升高更加明显。本研究还观察各组细胞的晚期凋亡情况，结果显示，LCL161可显著促进细胞的晚期凋亡，而当LCL161与多西他赛联用时，细胞数量明显减少，晚期凋亡更加明显。

研究[10,11]显示，在肿瘤细胞凋亡过程中，肿瘤坏死因子受体(TNFR)的激活可以调控多个信号传导通路，包括NF-κB的激活、RIP1非依赖性细胞凋亡(RIA)、RIP1依赖性细胞凋亡(RDA)和坏死性凋亡。在本研究中，我们检测了MCF-7细胞经过LCL161及多西他赛处理后细胞凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2及细胞程序性坏死蛋白RIP1表达的变化，发现多西他赛与LCL161联用时,凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2表达被抑制，程序性坏死蛋白RIP1被激活。我们认为，LCL161联用多西他赛诱导MCF-7细胞发生了程序性坏死，且是通过激活RIP蛋白信号通路这种程序性坏死的经典途径来实现的。以上结果证明了RIP家族蛋白在LCL161联合多西他赛诱导MCF-7细胞程序性坏死中的重要作用。

综上所述，LCL161联合多西他赛可抑制乳腺癌细胞的增殖，促进其凋亡；LCL161联合多西他赛可下调凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2的表达，上调程序性坏死蛋白RIP1的表达，进而诱导乳腺癌细胞的凋亡及程序性坏死来发挥抗肿瘤作用。