急性淋巴细胞白血病微小残留病检测的方法、标本选择、临床意义研究进展

丁超，单建芝，吕娅，曾云

(1昆明医科大学第一附属医院，昆明 650032;2云南省血液病研究中心)

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种起源于单个B或T淋巴细胞前体细胞的恶性肿瘤，可分为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)。ALL的病因不明，可能与离子辐射、先天易感性、化学物质、污染、病毒感染等因素有关。ALL总发病率约为1.0～1.5/10万，4～5岁、50～60岁两个年龄段高发峰。ALL是最常见的儿童急性白血病，其发病率逐占15岁以下儿童急性白血病的76%；而成人急性白血病中ALL仅占20%。化疗、及支持治疗是ALL的主要治疗方法，多数患者诱导化疗后可达到形态学缓解(光学显微镜下骨髓原始细胞<5%，造血功能恢复[1])甚至治愈；儿童ALL患者治愈率达到75%～80%；，仅30%～40%的成年ALL患者可长期生存。即使达到形态学缓解，ALL患者体内仍有106～108个白血病细胞，即微小残留病(MRD)[2]。MRD是指白血病患者经诱导化疗完全缓解后(或骨髓移植后)，在患者体内残存有形态学上不能检测到微量白血病细胞的状态。检测ALL患者MRD对改善患者长期生存率具有重要意义。现将ALL患者MRD检测的常用方法[3]、标本选择及其临床意义研究进展综述如下。

1 ALL患者MRD检测方法

1.1 多参数流式细胞仪(FCM) FCM由液流系统、光学系统及电子系统三部分组成，通过在液流系统中快速测定单个细胞的电阻、光散射和光吸收等性质来定量测算细胞直径、细胞膜受体和表面抗原等，快速测量对细胞或亚细胞结构。主要特点有：①测量速度快,1秒内可检测数万个细胞；②多参数测量,可对同一个细胞进行物理、化学特性的多参数测量，所得结果可用于统计学分析；③综合性高,FCM综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等多领域知识和成果；④识别白血病相关免疫表型(LAIPs), LAIPs存在于白血病细胞表面，包括抗原非同步表达、跨系列表达、过度表达/表达缺失；在正常骨髓细胞上不表达或低频率表达[4]，从而与正常细胞区分。FCM识别LAIPs的灵敏度可达0.01%～0.001%，超过90%的ALL患者可采用FCM测定MRD[5]。药物治疗及白血病细胞的异质性可导致LAIPs并发生免疫表型改变，即抗原漂移[6]，此时初诊时建立的模板无法准确判断MRD，导致结果出现假阴性。糖皮质激素可导致B-ALL患者血清CD10、CD34表达下降[7]。different from normal是利用FCM检测MRD的另一种方法，是指利用已经确定的健康人骨髓细胞的免疫表型谱检测并区分异常白血病细胞，主要优势是可不考虑初诊时患者LAIPs，避免抗原漂移导致的假阴性，但此方法较为费时[8]。文献[9]报道，在急性髓系白血病中，增加人类髓样抑制性凝集素C和CD123至FCM抗体组合中，可规避抗原漂移所致假阴性结果；但在ALL中，尚未见类似报道。实际上，增加抗体组合，选用多种检测方式，可提高MRD测定的阳性率。但FCM亦面临着诸多问题，如抗体组合的选择、设门方式、检验者的经验等，需要统一、规范的标准。阈值方面，虽然现在多为0.1%～0.01%，受制于仪器的种类、检验者的技术，各实验室间也缺乏统一的标准。

1.2 PCR 主要包括实时荧光定量RCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)两种。qPCR检测MRD的灵敏度为0.01%～0.001%。其原理为检测淋巴细胞表面克隆性的免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)基因重排[10]，适用于90%～95%的ALL患者，其高灵敏度、高标准化的特点使其在欧洲广泛运用。Ig/TCR基因重排时，由于不同V、D、J基因片段的随机组合，及其连接处随机丢失或插入部分碱基形成N区，使重排具有高度多样性；此外，体细胞突变进一步扩大了多样性，因此Ig/TCR基因重排对细胞及其子细胞具有特异性，可作为肿瘤特异性的标志。T-ALL、B-ALL患者均可出现TCR基因重排，且每个患者的基因重排具有特异性。因此Ig或TCR基因重排序列常作为PCR检测ALL MRD的靶基因。由于Ig/TCR基因重排具有高度多样性，因此，为提高检测的特异性，需要在每个患者初诊时检测其Ig/TCR基因重排，以此设计特异性引物和探针，从而增加了检测的难度；另外，在白血病病程中，10%～20% Ig/TCR基因重排可能发生克隆演化，将造成假阴性结果。RT-PCR测定MRD的原理为检测融合基因，其灵敏度为0.01%～0.001%。染色体易位常导致断裂点或其附近的基因结构或表达异常，形成特异性的融合基因，与白血病的发生、发展密切相关，由于其在白血病的发展过程中表达稳定，可直接反映了白血病的特征。如t(9;22)形成的BCR/ABL融合基因及儿童ALL中最常见的t(12;21)形成的TEL-AML1融合基因。但在ALL中，只有25%～40%的B-ALL、10%～15%的T-ALL可检测到融合基因的存在[11]，故其适用范围较窄，只针对有特殊融合基因的ALL患者。同时，RT-PCR法需提取RNA，再经过逆转录生成cDNA进行PCR扩增，有基因降解及交叉污染的可能性。

1.3 二代测序(NGS) NGS又称高通量测序、深度测序，可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，通常用来作全基因组测序、外显子测序、转录组测序及白血病MRD的检测。与qPCR法相同，其检测MRD时需要初诊时Ig/TCR重排相关信息，对ALL细胞Ig/TCR基因重排进行正确鉴定，灵敏度为0. 000 1%，较FCM及PCR法均高。其灵敏度一方面取决于测序读长的数量[12]；另一方面取决于投入DNA的总量：为了达到0. 000 01%的精确度，必须分析65 μg的DNA[13]。因为NGS允许使用共有引物进行快速、平行测序，所以不需要费力构建患者特异性引物，较qPCR法省时。NGS还提供有关生理B细胞库或T细胞库的有价值信息，因为样本中靶基因座的所有重排都是按顺序排列的。Michael等[14]比较了FCM与NGS对ALL MRD检测的差异，结果发现NGS较FCM对预测疾病复发与2年总生存率更准确，特别是对MRD阴性患者(复发率0%vs16%，P=0.02；2年总生存率96%vs77%,P=0.003)。且移植后检测MRD NGS较FCM能更好的预测复发，特别是移植后30 d(+30天时FCM MRD阳性与 NGS MRD阳性复发率分别为35%、67%，P=0.004)。Kotrova 等[15]比较了qPCR与NGS检测MRD对复发的影响，也得出了NGS较PCR更优。可以得出，NGS较PCR、FCM灵敏度更高，对ALL的危险分层、复发预测均更优，但其面临着复杂的生物学信息、校准器的应用、丰富的经验、后期数据的处理、费用昂贵、标本污染等一系列问题，需要更多的努力来解决。

2 ALL患者MRD检测标本的选择

临床上检测MRD的标本首选骨髓，尤其是B-ALL患者，骨髓能更好反应患者的疾病状态，但骨髓穿刺毕竟是一个有创性操作。那外周血能否作为MRD选择的标本呢？实际上，对儿童ALL经一线诱导化疗后完全缓解、MRD阴性的患儿，其复发风险极其低；若以骨髓MRD作为常规监测复发手段，频繁行骨髓穿刺，势必给患儿带来更多的痛苦。若能改进检测方法，优化测定方案，争取对所有ALL患者，用外周血代替骨髓测定MRD，可减少患者(尤其儿童)的痛苦及经费。Elaine 等[16]分析了226例初诊的ALL患儿，采集了718对外周血及骨髓标本，以FCM检测外周血及骨髓MRD，阈值为0.01%。发现有72对标本中，外周血及骨髓MRD均阳性；67对标本中，骨髓MRD阳性而外周血阴性；其余579对标本，骨髓及外周血MRD均阴性。值得注意的是，在150对T-ALL患儿标本中，骨髓及外周血MRD具有很好的一致性；且其中35对骨髓MRD阳性，而外周血亦阳性。而在B-ALL中，骨髓MRD阳性的104对标本仅有37份外周血MRD阳性。Van Der Velden等[17]亦得出了T-ALL中外周血和骨髓MRD一致性较好，而B-ALL中则不然。且在同一患者同时间的骨髓及外周血标本中，即使MRD均阳性，骨髓MRD较外周血MRD数值高约1 000倍。以上两组研究可以得出在T-ALL中，外周血或许可替代骨髓作为MRD检测的标本，而在B-ALL中则不能。而B-ALL外周血MRD可作为强烈的预后指标；若外周血MRD阳性，提示疾病越容易复发，预后越差。原因可能为前B细胞来源于骨髓，故骨髓MRD阳性率高于外周血；而前T细胞则来源于胸腺，白血病T细胞通过外周血迁移至骨髓，骨髓MRD与外周血MRD一致率较高。

3 ALL患者检测MRD的临床意义

3.1 危险分层指导治疗 初诊时我们常常根据患者的年龄、白细胞计数、细胞遗传学等相关因素进行危险分层，但治疗后发现，即使初诊时的低危患者，经过规范化的治疗，缓解后仍有部分复发，提示此危险分层方式并不完善，此时以MRD的水平进行危险分层显得格外重要。ALL治疗早期白血病细胞清除越多，残留越少，预后明显改善。AIEOP协作组[18]强调了诱导化疗第15天的MRD水平(FCM法)是一个独立的预后因素，并可用来预测复发。根据d15骨髓的MRD水平，分为3组：标危组(<0.01%)、中危组(0.1%-10%)、高危组(>10%)，5年累计复发率分别为7.5% 、17.5%,、47.2%，差异有统计学意义(P<0.001)。Vora等[19]回顾性分析了533例费城染色体阴性的1～24岁ALL患者，以开始治疗第29天骨髓MRD为标准，将MRD>0.01%(qPCR法)归为高危组，其后接受额外的强化治疗。与标准治疗的相比，中位随访70个月，5年无事件生存(EFS) (89.6% vs.82.8%,P=0.04)及总体生存率(OS)均有提高((92.9%vs88.9%，P=0.16)。提示对诱导缓解后MRD高水平患者，给予额外强化方案化疗能让患者获益。相反地，Vora等[20]将MRD低危患者(诱导化疗后MRD阴性或第29天MRD阳性但11周时MRD转阴)随机分成2组，一组接受1疗程强化治疗，另外一组接受2疗程强化治疗。最后得出两组患者EFS无明显差异(94.4% vs.95.5%)。Nathalie等[21]发现，诱导治疗后第一次缓解的费城染色体阴性的ALL患者接受造血干细胞移植，虽累计复发率较非移植组低，但其相当高的非复发死亡率似乎并不能让患者获益。提示对诱导化疗后MRD反应良好的低危患者，减少化疗次数是可行的，可避免过度治疗，减少化疗相关不良反应。

3.2 判断预后 Borowitz等[22]发现，外周血第8天及骨髓第29天的MRD阳性预示着更短的EFS；第29天(诱导治疗后)骨髓MRD阴性(<0.01%)与MRD可测到(0.01%～0.1%)相比，5年EFS分别为88%±1%、59%±5%，侧面得出MRD以0.01%为阈值具有临床意义。另外，多变量分析得出第29天骨髓MRD是最重要的预后因素。且巩固治疗后，MRD>0.01%提示预后不佳。另有文献[23]报道，ALL患者治疗6周后MRD阳性(PCR法，>0.01%)，复发率较MRD阴性患者明显增加。此外，ALL患者移植前后的MRD水平与疾病预后密切相关。Bar 等[24]回顾性分析了160例ALL完全缓解期患者接受了清髓性预处理的allo-HSCT，移植前50天内MRD阳性增加了复发率(风险比3.64,95%CI，1.87～7.06；P=0.0001)及死亡率(风险比2.39,95%CI，1.46～3.90；P=0.0005)。Peter等[25]研究发现移植后任何时间MRD>0.01%预示着疾病终会复发。提示随着时间的推移，移植后MRD持续阴性患者其累计复发率较MRD阳性者明显降低；对移植后任何时间MRD>0.01%的患者，需要密切监测，适时采取提前干预，避免血液学全面复发。

3.3 疗效判定指标 CD20单克隆抗体—利妥昔单抗在CD20+B细胞淋巴瘤的作用已经得到证明，那么其能否在B-ALL治疗中起到正性作用呢？Dieter 等[26]报道，在pre-B-ALL中，其原始细胞CD20阳性率为30%～50%。比较了117例CD20+使用利妥昔单抗(甲组)与70例CD20+未使用利妥昔单抗(乙组)的2组患者。观察了治疗后21天、16周甲组与乙组MRD阴性(<0.01%)率，得出了21天时甲组MRD阴性率与乙组分别为60%、19%，16周时分别为89%、57%，3年持续缓解率64%vs48%、总生存率75%vs54%。Rebecca A. Gardner等[27]的一项Ⅰ期试验表明，对CD19阳性的复发/难治B-ALL患者，行嵌合抗原受体T细胞免疫治疗(CAR-T)可使患者MRD阴性，且其可逆的相关不良反应，无治疗相关性死亡发生。

利妥昔单抗对降低CD20+pre-B-ALL MRD的水平具有一定作用，且针对CD7、CD5、CD3/CD7的免疫毒素在皮肤T细胞淋巴瘤、其他T细胞淋巴瘤及移植物抗宿主病的治疗中进行了测试[28]，其在T-ALL的作用需要更多的研究。

综上所述，ALL患者MRD常用的监测方法有FCM、PCR、NGS。F临床上检测MRD的首选标本为骨髓，但T-ALL患者外周血可作为MRD检测的标本。 ALL患者检测MRD可对患者并进行危险分层，危险分层，评估治疗反应，以采取不同的治疗策略，指导个体化治疗。 ALL患者检测MRD可帮助患者判断预后。ALL患者检测MRD可作为CD20单克隆抗体—利妥昔单抗治疗ALL效果的判定标准。