散发性主动脉猝死患者主动脉壁中膜层血管平滑肌细胞MYLK、MYH11、TGFβR2、MMP9的表达观察

潘赞,于子翔,马晓洁,马红, 马翔

(1新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐830054;2新疆医科大学基础医学院)

主动脉夹层(AD)是指在各种因素的综合作用下，血液经主动脉内膜撕裂口进入主动脉壁中膜层，形成假腔并严重危及生命的主动脉疾病[1]。AD发病突然,可导致猝死,病情进展迅速，极易漏诊和误诊[2]。AD是导致主动脉猝死(SAD)的主要原因之一，但我们认为“SAD”不应局限于AD发生1 h内的死亡病例，还应包括在医疗机构治疗并存活数天的病例[3]。研究[4]认为高血压及主动脉壁结构异常与AD的发生、发展密切相关。研究[5,6]发现，肌球蛋白轻链激酶(MYLK)、肌球蛋白重链11(MYH11)、转化生长因子β受体2(TGFβR2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)可通过影响TGF-β/Smad信号通路、细胞外基质的合成与降解的失衡、血管平滑肌细胞(VSMC)的收缩功能，破坏主动脉壁的正常结构及功能，导致家族性AD。但临床上AD的发生多以散发病例为主，目前关于MYLK、MYH11、TGFβR2和MMP9在散发性AD发生发展中的可能作用机制相关研究较少。2006年1月～2017年12月，我们观察了27例散发性SAD患者主动脉壁中膜层VSMC中MYLK、MYH11、TGFβR2和MMP9的表达变化，探讨其在散发性AD发生发展中的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2006年～2017年新疆新医司法鉴定所收集的27例散发性SAD患者的主动脉壁标本(SAD组),患者中男22例，女5例，年龄26～70(42.6±9.7)岁，均为尸检明确死因为AD；病理可见，主动脉壁内膜与中外膜分离，可见大量血液；中膜层弹力纤维、胶原纤维及平滑肌细胞变性坏死，排列紊乱，并伴有炎性细胞浸润。27例患者中13例(48.1%)被误诊，分别被误诊为冠心病(3例)、急性胃肠炎(3例)、急性消化道出血(2例)、急性胆囊炎(2例)、肺炎(1例)、输尿管结石(1例)、脑梗塞(1例)；其余14例(52%)发病1 h内死亡，尸检前均无明确临床诊断;16例在医院内死亡，4例在诊所死亡；其余7例为院外死亡；按照DeBakey的分类标准分类为DeBakey Ⅰ型10例(37.0%)、DeBakey Ⅱ型15例(55.6%)、DeBakey Ⅲ型 2例(7.4%)；病理改变为动脉粥样硬化11例(40.7%)，高血压病理改变7例(25.9%)，主动脉炎9例(33.3%)，且主要病变均在主动脉壁中膜层；心脏重量350～515(424.3±39.8)克，其中心脏重量≥400克者22例(81.5%)，心脏重量<400克者5例(18.5%)；死亡原因为心包填塞20例(74.1%)，失血性休克7例(25.9%)；27例患者均排除先天性心脏病、主动脉瘤、家族性主动脉疾病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病、免疫系统疾病、外伤、糖尿病、感染、恶性肿瘤，且纳入研究对象间无血缘关系。另选择同期新疆新医司法鉴定所的27例死因排除AD猝死患者的主动脉壁标本(对照组)，其中男21例，女6例，年龄27～72(43.3±9.7)岁，均为尸检明确死因为窒息、溺水或冠状动脉痉挛，排除高血压、先天性心脏病、主动脉瘤、家族性主动脉疾病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病、免疫系统疾病、外伤、糖尿病、感染、恶性肿瘤，且纳入研究对象间无血缘关系；病理可见对照组主动脉壁结构完整，弹力纤维、胶原纤维及平滑肌细胞排列紧密有序，未见中膜层退行性变。两组年龄、性别比例等临床资料具有可比性。本研究经过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准同意。专业人员告知两组入选者家属关于本研究主要的研究内容及目的，并经入选者家属同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂 兔抗人MYLK多克隆抗体、兔抗人MYH11多克隆抗体、兔抗人MMP9多克隆抗体、兔抗人TGFβR2多克隆抗体购自Abcam-艾博抗(上海)贸易有限公司，免疫组化PV-6000试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 两组主动脉壁中膜层VSMC中MYLK、MYH11、MMP9和TGFβR2检测 采用免疫组化SP法检测两组VSMC中MYLK、MYH11、MMP9和TGFβR2。取两组SAD患者主动脉组织标本。烘片后脱蜡，柠檬酸钠缓冲液煮沸10 min进行抗原修复，滴加一抗，4 ℃冰箱过夜。反复PBS冲洗，二抗室温孵育1 h，DAB染色和苏木素复染5 min，盐酸乙醇分化2 s，脱水、透明、封片、烤片。应用Leica显微镜及Qwin图像采集软件(V3．3．1)采集两组SAD患者。免疫组化阳性表达细胞为胞质可见浅黄色、棕黄色或棕褐色染色颗粒的VSMC细胞。400倍显微视野下随机选择10个高倍视野，应用Qwin V3软件，计算阳性细胞占整个视野细胞百分比。评估标准为为阳性表达细胞占整个视野细胞总数的百分比：0～5%为阴性，6%～25%为弱阳性，26%～50%为阳性，>50%为强阳性，弱阳性、阳性、强阳性均判为MYLK、MYH11、TGFβR2和MMP9表达阳性，计算阳性表达率(阳性例数/总例数×100%)。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。重复3次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 for Windows统计软件进行统计处理。计数资料以率或者构成比表示，两组间比较用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

SAD组主动脉壁中膜层VSMC中MYLK、TGFβR2和MYH11阳性细胞数量减少，着色浅；MMP9阳性细胞数量明显增多，可见大量棕褐色染色颗粒；对照组主动脉壁中膜层VSMC中MYLK、TGFβR2和MYH11阳性细胞数多，着色深，弹力纤维和胶原纤维排列整齐有序；MMP9阳性细胞较少，少见阳性着色。SAD组主动脉壁中膜层VSMC中MYLK、TGFβR2、MYH11、MMP9阳性表达率分别为25.9%(7/27)、29.6%(8/27)、18.5%(5/27)、88.9%(24/27)，对照组主动脉壁中膜层VSMC中MYLK、TGFβR2、MYH11、MMP9阳性表达率分别为77.8%(21/27)、74.1%(20/27)、81.5%(22/27)、29.6%(8/27)。与对照组比较，SAD组主动脉壁中膜层VSMC中MYLK、TGFβR2、MYH11阳性表达率升高，MMP9阳性表达率降低(P均<0.05)。

3 讨论

AD是一类发病危险因素复杂的严重血管性疾病。目前研究认为高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、炎性反应、肥胖、Marfan综合征、性别差异、高龄等危险因素与AD的发病机制有关[7]。既往研究[8]显示主动脉夹层发病年龄高峰为50～79岁，男女性比例为1.9∶1。本研究中，SAD组发病年龄高峰为 30～49 岁(74.1%)，猝死者以中青年男性为主，且多伴有动脉粥样硬化、高血压及主动脉炎。性别(男性)、动脉粥样硬化、高血压及主动脉炎可能是导致AD发病的重要危险因素，提示AD的发病有年轻化趋势，这与既往研究结果不同，这可能与生活方式、饮食结构改变及研究样本量较小等有关。心脏重量可以作为高血压及其他心脏疾病的辅助诊断依据，心脏病理性肥大可见于长期高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心瓣膜病和心肌病[9]，AD猝死者可能出现心脏重量增加。研究[10]报道显示，中国成年男性正常心脏重量为(285±19.45)克，成年女性为(268±19.52)克。本研究结果显示，AD猝死者心脏重量为350～515(424.3±39.8)克，明显超过国内成人正常心脏重量，提示SAD患者存在心脏病理性肥大，这可能与AD猝死者大多罹患高血压、动脉粥样硬化及心肌缺血等疾病有关。

AD的发病机制复杂。主动脉壁中膜层退行性病变是AD发病机制之一，而主动脉壁中膜层结构的完整性依赖于VSMC收缩功能、 TGF-β/Smad信号通路、细胞外基质的合成与降解的平衡。本研究结果发现，AD患者主动脉壁主要表现为中膜层弹力纤维、胶原纤维及平滑肌细胞变性坏死、排列紊乱，证明中膜层部位是AD的治疗靶点。我们通过免疫组化染色发现：MYLK、MYH11、TGFβR2和MMP9阳性细胞也主要在主动脉中膜层中表达。因此，中膜层病变可能与这四种蛋白的表达失调存在一定的相关性。

目前，VSMC表型转换异常是AD发病机制的研究热点[11]。其中，VSMC是主动脉壁中膜层的主要成分之一，在维持血管壁的平衡中起关键作用。正常VSMC以收缩型为主，用于维持血管弹性及抗机械力。但在病理条件下，VSMC由收缩型向合成型表型转换，导致平滑肌细胞和肌成纤维细胞的平滑肌收缩蛋白低表达，收缩功能异常，血管壁弹性、抗张能力、顺应性下降，诱发AD的形成。Kuang等[12]研究发现，MYH11基因编码VSMC特异肌球蛋白重链，MYH 11基因表达下调，能改变肌球蛋白收缩功能及平滑肌细胞表型，诱发AD。而MYLK与PRKG1一起共同编码控制VSMC收缩的激酶，MYH11、MYLK共同参与VSMC收缩通路及肌动蛋白细胞骨架通路。在本研究中，我们发现与正常对照组相比，AD组中弹力纤维、胶原纤维断裂破坏，VCMC变性坏死，VSMC的收缩型标志物MYLK、MYH11阳性细胞数量明显减少，着色浅，表达显著减少。提示在AD的形成过程中存在MYLK、MYH11表达失调最终引发VSMC表型转换异常，导致血管弹性及抗机械力下降，进一步促进AD的形成。因此， MYLK、MYH11表达下调可能在 AD 的形成中具有重要作用。

TGF-β/Smad 信号通路异常调控 VSMC的表型转化是 AD 的主要发病机制之一[12]。TGF-β参与多种细胞的生理进程，TGF-β与 TGF-β受体(TGF-βR)特异性结合后再与下游信号分子 Smads 结合，进入细胞核调控靶基因的表达。Li等[13]研究发现，在MFS小鼠模型中，TGFβR1、TGFβR2的表达下调,将导致TGFβ信号的过度表达，而 TGF-β可诱导VSMC由收缩型向合成型的表型转化，并促进 TGF-β活化、释放，同时引起 VSMC增殖和迁移，导致 AD 发生。本研究结果发现AD组主动脉壁中膜层中TGFβR2、MYLK和MYH11阳性细胞数量明显减少，着色浅，呈低表达，均较对照组明显减低，说明TGFβR2表达下调时,可能通过影响TGF-β/Smad 信号通路，导致平滑肌收缩蛋白MYLK、MYH11低表达，引起中膜层变性坏死，促进AD的形成。研究[14]发现，TGFβR2基因突变的家族性胸主动脉瘤和Loeys-Dietz 综合征患者的主动脉 VSMC 中，平滑肌收缩蛋白MYLK、MYH11低表达，提示TGFβR2基因突变所致的TGF-β信号传导异常可引起VSMC表型改变,导致平滑肌收缩功能异常，血管重塑,引起AD。

研究[15]证实细胞外基质(ECM)的合成和降解失衡可能在AD的产生、发展中发挥作用，任何可能导致ECM结构及功能改变的通路和分子都可能参与AD的发生。VSMC能够影响ECM的合成及分泌，而ECM主要由胶原纤维和弹性纤维组成,胶原纤维和弹性纤维的减少将促进AD的形成。金属蛋白酶(MMP)及其组织抑制剂(TIMP)是一类能够降解ECM、重塑细胞外基质蛋白的锌指酶类。MMP主要通过对ECM的蛋白水解作用降解ECM,并且主要由平滑肌细胞、成纤维细胞和炎症细胞产生和释放。而MMP9属于MMPs中的明胶酶类，对弹力蛋白和胶原均有降解作用，是降解ECM最重要的酶之一[16]。AD组的病理特征主要表现为中膜层弹力纤维、胶原纤维及平滑肌细胞变性坏死，排列紊乱，并伴有炎性细胞浸润。这表明，VSMC表型转换异常、高血压所致血管壁的慢性炎症反应均可能会促进MMP9表达增强，导致ECM的合成与降解失衡，诱发AD。本研究中AD组主动脉壁中膜层MMP9阳性表达率高于对照组，并可见胶原纤维和弹性纤维的结构破坏严重，提示正常主动脉中膜层内的MMP9含量较少。由此可以推测MMP9的含量增高与ECM的破坏存在相关性,MMP9可能分解大量的包括胶原纤维与弹性纤维在内的外基质蛋白，导致ECM的合成与降解失衡，破坏主动脉壁组织的正常层状结构从而导致AD。

综上所述， 散发性SAD患者主动脉壁中膜层VSMC中MYLK、MYH11、TGFβR2低表达，MMP9高表达。MYLK、MYH11、TGFβR2、MMP9表达变化可能与散发性SAD的发生、发展有关。