脑出血前后灯盏花素腹腔注射大鼠脑损伤程度观察

蓝先旗，麦惠强，宁晔，王凤丽，梁仔

(1中山市人民医院，广东中山528403;2广东医科大学附属廉江医院)

脑卒中特别是出血性脑卒中已成为我国居民第一死亡原因[1]。脑出血早期手术清除血肿及药物保守治疗是影响治疗效果的关键[2]。核因子κB(NF-κB)p65、Notch家族受体蛋白1(Notch1)均为临床常用的炎症指标。灯盏花素是从灯盏花全株植物中提取分离的黄酮类有效成分,化学名为4,5,6,三羟基甲酮-7-葡萄糖醛酸苷[3,4]，在清除氧自由基、抗氧化,抑制蛋白激酶C等多方面产生作用,在心血管疾病等领域应用广泛[5]。近年来，研究[6]发现，灯盏花素治疗高血压、脑出血效果较好。但灯盏花素在出血性脑卒中治疗中的具体作用机制鲜被深入探讨。2018年1～5月，我们观察了灯盏花素对脑出血模型大鼠早期脑损伤的影响，并探讨其可能作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂及仪器 健康SD雄性大鼠96只，体质量280～300 g，由南方医科大学实验动物中心提供。灯盏花素(meilunbio公司，货号MB5170)，大鼠冠状脑模具(莱艾特，货号：LAT-DSGZNBJ)兔单克隆抗NF-κB p65(美国CST公司, 货号：7174S)，DAB显色液(北京中杉金桥公司)，各相应免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥公司)，IV 型胶原酶0.5U(美国Sigma公司)，戊巴比妥钠(美国Sigma)，电泳仪及电泳槽(美国Amersham公司)，DBJ_2000凝胶成像系统(英国UVIpro公司)。

1.2 大鼠分组、脑损伤模型制备及灯盏花素给予方法 取96只SD大鼠，随机分为A(假手术组)、B(脑出血组)、C(低剂量灯盏花素干预组)、D组(高剂量灯盏花素干预组)，每组各24只。B、C、D组采用尾状核定位注射制作脑出血模型，A组仅针刺尾状核定位注射。脑出血模型制备方法：戊巴比妥钠麻醉大鼠，头部固定于立体定位仪，常规消毒头皮，于中线约3 mm右侧处切开长约1 cm纵行切口，在距离前囟前1.5 mm、中线右侧3 mm的位置用牙科骨钻钻一个直径约1 mm小孔，暴露出硬脑膜。用经消毒灭菌的无菌微量注射器抽吸无菌胶原酶Ⅳ 0.2 U(0.2 U胶原酶溶解于1 μL无菌生理盐水中)，在立体定位仪上将微量注射泵进行安装固定。通过骨孔中央立体定向地垂直进针进入SD大鼠的脑右侧尾状核(立体定位坐标是：以前囟为参照，前囟前0.1 mm，前囟侧3.5 mm，前囟腹侧6 mm)，将无菌胶原酶Ⅳ 0.2 U(1 μL)匀速注射，注射时间超过5 min。注射完毕将微量注射器针头保持在原来位置10 min，阻止回流。A组微量注射器针头仅同部位针刺，保留相同留针时间，但不进行药物注射。造模后各组SD大鼠单独放于鼠笼中，随意获得食物和水。C、D组分别于造模前1 h及造模1、6、12 h时腹腔注射50、100 mg/kg的灯盏花素，B组分别于造模前1 h及造模1、6、12 h时腹腔注射1 mL生理盐水，A组不做任何处理。

1.3 各组大鼠脑出血体积及脑组织含水量测算 造模24 h时每组各取6只大鼠处死，取脑组织切片，得到血肿最大层面，后以切面为起始，2 mm层厚切片，选取所有含血肿切片，依序摆齐，记录所有标本含血肿层数，并用高分辨摄像机拍摄记录血肿最大层面。用Image J(V1.45)软件分析测算最大截面面积，采用“改良多田公式法”估算每个标本的出血体积(V)。V=a×b×c×1/2×0.2，其中a为最大血肿面积层面血肿最长径，b为最大血肿面积层面上与最长径垂直最长径，c为大体组织中出现血肿切片数(默认层厚0.2 cm)。重复3次，取平均值。采用干湿比重法测算各组大鼠脑组织含水量：造模24 h时每组各取6只大鼠，处死后新鲜脑组织，吸除脑组织表面液体，分析天平上称取其湿重，100 ℃烘干至恒重。计算各组脑含水量比重。脑含水量比重=(湿重-干重)/湿重×100%。重复3次，取平均值。

1.4 各组大鼠血肿周围脑组织NF-κB p65及脑组织NF-κB p65、Notch1蛋白检测 ①采用免疫组化法检测各组大鼠血肿周围脑组织NF-κB p65。造模24 h时每组各取6只大鼠处死，处死后取新鲜脑组织，制作血肿周围脑组织石蜡切片。利用Leica Qwin生物医学图像分析系统测算各组大鼠血肿周围脑组织NF-κB p65，NF-κB p65以光密度OD值表示。阴性对照用PBS代替一抗进行孵育，排除假阳性结果。每只大鼠选取2张切片，取6只大鼠平均灰度值为NF-κB p65的相对表达量。②采用免疫蛋白电泳法检测 各组大鼠脑组织NF-κB p65、Notch1蛋白 。造模24 h时每组各取6只大鼠处死，处死后取新鲜脑组织，采用增强的化学发光来可视化检测试剂盒使图像发光，使用Quantity One软件对蛋白进行定量分析，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组大鼠脑出血体积比较 A、B、C、D组大鼠脑出血体积分别为(1.62±0. 87)、(106.87±25.35)、(79.31±11.46)、(72.69±10.61)cm3，与A组比较，B、C、D组大鼠脑出血体积增加(P均≤0.05)，与B组比较，C、D组大鼠脑出血体积减小(P均≤0.05)，与C组比较，D组大鼠脑出血体积减小(P≤0.05)。

2.2 各组大鼠脑组织干湿比重比较 A、B、C、D组各组大鼠脑组织干湿比重分别为76.71±0.44、82.87±0.86、78.92±1.02、76.66±0.94，与A组比较，B、C组大鼠脑组织干湿比重增加(P均≤0.05)，与B组比较，C、D组大鼠脑组织干湿比重降低(P均≤0.05)，与C组比较，D组大鼠脑组织干湿比重降低(P≤0.05)。

2.3 各组大鼠血肿周围脑组织 NF-κB p65相对表达量比较 A、B、C、D组大鼠血肿周围脑组织 NF-κB p65相对表达量分别为46.79±21.52、132.58±13.95、73.63±10.29、51.96±4.83，与A组比较，B、C、D组血肿周围脑组织NF-κB p65相对表达量增加(P均≤0.05)，与B组比较，C、D组血肿周围脑组织 NF-κB p65相对表达量降低(P均≤0.05)，与C组比较，D组血肿周围脑组织 NF-κB p65相对表达量降低(P≤0.05)。

2.4 各组大鼠脑组织NF-κB p65、Notch1蛋白相对表达量比较 A、B、C、D组脑组织NF-κB p65的相对表达量分别为0.24±0.06、0.84±0.09、0.66±0.09、0.56±0.07，A、B、C、D组脑组织Notch1的相对表达量分别为0.44±0.08、0.98±0.10、0.80±0.17、0.74±0.10，与A组比较，B、C、D组脑组织脑组织NF-κB p65、Notch1的相对表达量增加(P均≤0.05)，与B组比较，C、D组脑组织NF-κB p65、Notch1的相对表达量降低(P均≤0.05)，与C组比较，D组脑组织NF-κB p65、Notch1的相对表达量降低(P≤0.05)。

3 讨论

脑出血后早期脑损伤病情转归除与血肿大小、部位等有关外，主要取决于水肿的程度、炎症通路的激活状态。脑出血后早期脑损伤的产生机制既有水肿形成参与，也有各种炎症凋亡通路如NF-κB信号通路的介导，其中NF-κB p65的是该通路研究的重点之一[7]。新近有研究[8]发现，Notch1是NF-κB凋亡作用的重要上游，其主要分布在血管周围，且参与血管生长发育调节，其表达与血管新生、血管畸形等有重要关联。还有研究表明，在脑出血组织中，Notch1表达明显增加[9]，这进一步研究Notch1与脑出血存在重要关联。NF-κB p65作为经典NF-κB信号通路的重要成员，其表达在脑出血中明显增加。

Notch活化酶的抑制剂DAPT γ-分泌酶治疗可减少对脑的损伤。 然而，支持这种治疗效果的分子机制尚不完全清楚。有研究[10]表明，证明Notch / RBP-J信号传导在NG2+神经胶质祖细胞和反应性星形胶质细胞如GFAP+细胞，巢蛋白+细胞和RC2+细胞中被激活，使用Notch / RBP-J信号传导报道小鼠。3天DAPT治疗减少了反应性星形胶质细胞的数量，但没有减少NG2+神经胶质祖细胞的数量。 BrdU标记实验表明，这种减少是由于反应性星形胶质细胞的增殖减少。 DAPT抑制Olig2的核转位，Olig2对于反应性星形胶质细胞的增殖和分化是必不可少的。

灯盏花素是从中国药典收藏重要灯盏细辛中提取的黄铜活性成分，主要药理作用是降低血液黏度、抑制清除自由基、抗氧化，抑制蛋白激酶C，减轻炎症反应和改善脑微循环，从而具有减轻脑出血后早期脑损伤的潜力。有研究[11,12]发现，灯盏花素对脑组织炎症应激起保护作用，且在脑缺血损伤动物实验中，灯盏花素明显改善预后。研究[13]证实，灯盏花素可能通过抑制钙超载、减少自由基释放其脑保护作用。且灯盏花素对脑损伤是出现的Na+、K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性下降有明显的抑制作用，并能降低脑组织含水量[18]，减轻脑水肿的程度。

脑出血后因受损伤和炎症刺激，炎症级联反应被触发，炎性因子例如IL-6、TNF-α、MMP-9等释放增多，通过多种分泌方式与靶细胞上IL-6、TNF-α等受体结合产生作用，其中重要的NF-κB信号通路，可能在脑出血作用下被激活，且通过Notch1这一上游蛋白调控产生作用。本研究结果发现，与B组比较，C、D组大鼠脑出血体积、脑组织干湿比重减小，且D组减少更明显。与B组比较，C、D组血肿周围脑组织 NF-κB p65相对表达量降低，且D组降低更明显。与与B组比较，C、D组脑组织NF-κB p65、Notch1相对表达量降低，且D组降低更明显，说明灯盏花素在脑出血疾病中的脑保护作用，灯盏花素干预后大鼠脑出血周围组织中NF-κB p65这一经典炎症凋亡因子表达明显减少。灯盏花素可能通过抑制NF-κB p65与Notch1表达产生作用。进一步推断，灯盏花素可能通过抑制Notch/NF-κB信号通路介导减轻大鼠脑出血模型早期脑损伤。

综上所述，灯盏花素腹腔注射可减轻脑出血模型大鼠早期脑损伤程度，且高剂量(100 mg/kg)时作用更明显。其机制可能为抑制NF-κB p65、Notch1的表达。但灯盏花素对脑出血大鼠抗炎症反应的具体互作机制、治疗时合适时间窗、持续时间治疗效果等问题尚有待于进一步研究。