超声分散技术前处理的痰标本分枝杆菌培养观察

田鹏，王俊玲，凌晓洁，张真金，尹诗维，邓云峰

(山东省胸科医院汉光国际微生物实验室,济南250013)

近年，结核病的发病率居高不下。早发现、早处理对结核病患者的预后具有重要意义。肺结核病依然是我国重点防控的主要传染病，实验室诊断是我国十三五结核病防治规划的核心内容。痰标本的分离培养检测不仅是结核病实验室诊断的“金标准”，并且还是开展药物敏感试验、分枝杆菌菌种鉴定、基因分型，以及各种基础研究的前提。影响痰分枝杆菌培养污染率和阳性检出率最关键因素是前处理方法的选择，因此，改良与创新分枝杆菌培养前处理方法是国内外专家和学者们研究的热点[1～4]，但目前国内外专家均把改良和创新关注点大多放在了前处理液的选择上，临床尚未见将超声分散技术应用在痰分枝杆菌培养的前处理过程中的报道。目前，越来越多的技术和方法被应用到临床实验室，超声分散技术就是其中之一。超声分散技术的原理为超声波发生器发出高频振荡信号，在介质中产生高频机械振荡，使结团物质在液体内均匀分散。我们采用超声分散技术前处理了400例份痰标本,并观察其分枝杆菌培养效果。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源 根据2015年版《结核病实验室检验规程》[5]中痰标本收集的要求，连续收集山东省胸科医院2018年1～8月间收治的387例疑似肺结核患者的痰液标本，共400例份，标本量为3～5 mL。387例患者中男260例、女127例，年龄12～89岁(50±13)岁。400例份干酪样痰标本平行均分为A、B、C组及对照组。本研究经本院伦理委员会批准同意，纳入者均知情同意并签署知情同意书。。

1.2 仪器和试剂 超声分散仪使用广东体必康生物科技有限公司的超声波发生器(固定频率小于50 kHz)，4%氢氧化钠(NaOH)溶液为本实验室自配，酸性改良罗氏培养基使用珠海贝索生物科技有限公司产品。研究中获得的所有培养产物使用BD布鲁克质谱仪进行菌株鉴定。

1.3 超声分散处理及分枝杆菌培养 实验组采用超声分散技术进标本前处理，将1 mL痰标本与1～2 mL的4%NaOH溶液混合，放入超声分散仪中超声处理1 min，室温静置5 min后，接种于酸性改良罗氏培养基进行分枝杆菌培养。对照组根据2015年版《结核病实验室检验规程》分枝杆菌培养标本前处理简单法操作：将1 mL痰标本与1～2 mL的4% NaOH溶液混合，并在涡旋振荡器上涡旋震荡30 s左右直至痰标本充分液化，室温静置15 min，接种于酸性改良罗氏培养基进行分枝杆菌培养。

1.4 观察指标及方法 连续观察各组分离培养的生长情况，观察并记录各组菌株生长并判定为抗酸杆菌阳性的时间，测算各组分枝杆菌培养阳性率(阳性菌株例份/总例份)，各组菌株生长并判定为糠酸杆菌阴性的视为标本被污染，计算标本污染率(阴性菌株例份/总例份)。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行数据处理。计量资料比较采用秩和检验计数资料，以n及%表示，比较采用χ2检验。二分类变量及无序多分类变量的组内与组间差异比较采用χ2检验，非正态分布的计量资料。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

实验组及对照组实验组及对照组出现阳性菌株时间分别为(20±8.11)、(20±7.67)d。实验组、对照组分枝杆菌培养阳性率分别为30.0%(120/400)、23.5%(94/400)(P<0.05)。实验组、对照组培养污染率分别为1.0%(4/400)、4.8%(19/400)(P<0.05)。

同一标本在对照组生长并判定为其它细菌污染而被实验组报告阳性的为13例份，同一标本在对照组生长并判定为抗酸杆菌阳性而被实验组报告阴性的为1例份，同一标本在对照组不生长判定阴性而被实验组报告阳性的为13例份。

3讨论

痰标本是一种成分复杂的标本类型，通常情况下可有多种菌体共存,分枝杆菌分离培养标本前处理的目的就是尽可能杀灭痰标本中的污染菌来控制污染率，同时还要最大限度的保持分枝杆菌的活力以提高阳性检出率。首先，标本的正确采集和留取非常重要。对于痰标本，患者口腔正常菌群、口腔卫生状况是造成污染的主要原因。文献[6～8]报道，患者留取痰标本前刷牙、用凉开水或洗必泰漱口，痰培养污染率可明显降低。其次，操作技术、前处理方法等因素都与痰分枝杆菌培养污染率和阳性检出率密切相关。大量国内外研究[1～4]显示，影响痰分枝杆菌培养污染率和阳性检出率最关键因素是去前处理的方法的选择。WHO现行指南要求前处理时NaOH的终浓度为1%～2%，但也有文献[9，10]报道，终浓度为1%～2% 的NaOH前处理方法在去除葡萄球菌属、肺炎克雷伯菌、肠球菌、黏质沙雷菌、嗜麦芽窄食假单胞菌等污染菌方面不是有效的方法。傅津平等[11]提出在痰分枝杆菌培养前处理时采用0.1%新洁尔灭代替4%的NaOH，有较好的前处理效果，痰污染率为0.4%，培阳率为 38.8%。本研究引进新技术成果，将超声分散技术应用于痰分枝杆菌培前处理的过程，通过分枝杆菌培养阳性率、分枝杆菌培养污染率等指标比较四组不同前处理方法的优劣，以探讨超声分散技术在痰分枝杆菌培养中的应用价值。

本研究采用的对照组前处理方法为经典的技术，从1931年 Lowenstein 和 1932 年 Jensen 发明罗氏培养基(L-J)开始，一直沿用至今，也是我国相关操作指南推荐在基层结核病实验室广泛使用的分枝杆菌培养的前处理方法(简单法)[12]。赵立平[2]等在报道中认为，简单法的检出阳性率与离心法接近，但操作相对简单、污染率较低，初生长时间也相对较短，因而可能更符合临床的需要。实验组前处理方法是在简单法前处理方法的基础上加入超声分散技术。超声分散技术的原理[13]为超声波发生器能够发出高频振荡信号在介质中产生高频机械振荡，使液体振荡，产生数以万计的微小气泡(即空化核)。空化核在声场的作用下振动，当声压达到一定值时，气泡迅速增长，然后突然闭合，在气泡闭合时产生冲击波，在其周围产生上千个大气压，破坏结团的物质，使结团物质在液体内均匀分散，简称“空化”作用。Nor Saadah等[14]提出，超声波在液体中对于细菌的杀伤作用有两方面，第一产生物理“空化”作用，第二产生化学作用即能使水分子解离，增加去污染溶液的杀菌效果。同时，超声波在液体中杀菌作用强弱，还与细菌本身特点有关，例如细菌的大小、细胞壁的成分厚薄程度及细菌是否有芽孢荚膜等。

本研究对400例痰标本分离培养总体阳性率和总体污染率以及同一标本在不同组间分离培养生长情况的观察结果显示：实验组的前处理方法与对照组相比较，实验组分枝杆菌培养阳性率增高且污染率降低，这说明与对照组相比，实验组能够在充分保护痰中分枝杆菌活性的基础上，增加对痰中污染菌的抑制，能够更好的避免因污染菌生长而造成的阳性标本漏检；且实验组前处理过程用时短，缩短了痰分枝杆菌培养实验过程的时间成本。同一标本在不同组间分离培养的生长情况显示，对照组19例报告污染的痰标本中，有13例在实验组报告了培养阳性，也再一次证明了实验组的前处理方法能更好的避免因污染菌生长而造成的阳性标本漏检。对13例痰标本分析发现，标本性状较为特殊，均为十分黏稠的干酪样痰。这提示可能在处理特殊性状的痰标本特别是十分黏稠的干酪样痰时，实验组的方法更优。

综上所述， 超声分散技术前处理的痰标本去污染效果明显，可有效杀灭痰标本中的污染菌，同时保持分支杆菌的活力，分枝杆菌培养阳性检出率高，且超声分散计数前处理所需时间短。