吡格列酮对单钠尿酸盐诱导THP-1细胞炎症反应的影响及其机制

杨珂珂，杨兴义，陆静，徐玉梅

(同济大学附属上海市第四人民医院，上海200080)

目前已经明确痛风的病因为嘌呤代谢紊乱，即尿酸排泄减少或生成过多。当血液中尿酸持续升高，就会以单钠尿酸盐(MSU)的形式沉积于关节及脏器中，导致急性炎症反应和病理损伤[1～3]。随着生活水平的不断提高，高尿酸血症的发病率越来越高，特别是经济发达地区和沿海城市，患者率高达23.5%[4]。但是治疗痛风的手段非常有限，所涉及痛风急性发作期的药物主要有三大类，即秋水仙碱、非甾体类消炎止痛药物和糖皮质激素类，这些药物长期应用，均存在一定的副作用。因此，发现新的干预靶点，对研发可适用于长期安全使用的新药有着重大意义。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)是由配体激活的核转录因子，是核素受体超家族中的成员， PPAR-γ活化可产生较强的抗炎作用[5]。吡格列酮是人工合成的高亲和力PPAR-γ配体，因可改善胰岛素抵抗，目前已广泛应用于2型糖尿病的治疗。已有研究表明吡格列酮作为PPAR-γ激动剂可使PPAR-γ活化从而减轻MSU诱导的大鼠急性痛风关节炎、大鼠急性腹膜炎和小鼠皮下气腔炎症[6,7]，但具体机制尚不清楚。本研究采用体外实验探讨吡格列酮抑制炎症反应的机制，以期为痛风提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人单核细胞(THP-1细胞)购自美国ATCC；DMSO培养基、佛波酯(PMA)购自美国 Sigma公司；FBS、EDTA购自美国Gibcog公司；吡格列酮(Piog，PPAR-γ激动剂)、T0070907(PPAR-γ抑制剂)、LY294002即蛋白激酶B(AKT)抑制剂购自美国Abmole公司；AKT抗体、p-AKT抗体购自美国Cell Signaling Technology；PPAR-γ抗体购自北京柯诺迪商贸有限公司；IL-1β ELISA试剂盒购自上海拓然生物科技公司；流式试剂盒购自美国Biolegend公司；MSU购自美国Sigma公司。6孔细胞培养板、T25培养瓶购自美国Corning公司；倒置显微镜、活细胞工作站购自莱卡纤维系统(上海)贸易有限公司；双色激光ODYSSEY成像系统购自美国LI-COR公司；电泳槽和电转仪购自美国Bio-Rad公司；酶标仪、实时荧光定量PCR仪、CO2细胞培养箱均购自美国Thermo公司。

1.2 THP-1细胞培养及分组 THP-1细胞于含10%FBS+1%P/S的RPMI1640培养基中培养，培养环境为37 ℃、5%CO2，每3～4 d换液1次。当细胞密度达到8×105/mL左右时，直接将细胞吸出，离心之后传代。取大约1×107个细胞，用1 mL含有10%DMSO的FBS重悬，转入冻存管，于-80 ℃冰箱过夜，第2天移入液氮中长期保存。将上述THP-1培养细胞分为PBS预处理组、T0070907预处理组、Piog预处理组，将上述三组细胞加PMA预处理24 h，分别以PBS(1%,500 μL)、T0070907(100 ng/mL，1 mL)、Piog(100 μg/mL,500 μL)预处理1 h,再各分两组,一组不予干预，一组以MSU(100 μg/mL,1 mL)刺激16 h，继续在37 ℃、5%CO2环境中培养，得到PBS组、T0070907组、Piog组、MSU组、MSU+T0070907组、MSU+Piog组。分别收集上清及细胞备用。

1.3 各组IL-1β标记阳性THP-1细胞构成比检测 采用流式细胞术。取6支试管，每支试管加入上述各组THP-1细胞1×106个，然后加入50 μL染色缓冲液稀释的IL-1β抗体2 μL，阴性对照管仅加入50 μL的缓冲液，暗处室温孵育15～30 min。每管加2 mL 1×RBC Lysis Buffer 预热至室温,轻轻混匀。孵育10 min，离心，去上清，2 mL染色缓冲液洗1次,PBS洗1次，重悬细胞并涡旋振荡。加入1 mL新鲜工作固定液，涡旋振荡，孵育30～60 min，流式细胞染色缓冲液重悬细胞，上机分析，得到各组IL-1β标记阳性的THP-1细胞，计算IL-1β标记阳性的THP-1细胞构成比。

1.4 各组THP-1细胞上清液IL-1β水平检测 采用ELISA法。按照试剂盒操作说明书进行操作，酶标仪于450 nm波长处测定每组的吸光度，建立标准曲线，根据标准曲线计算各组THP-1细胞上清液IL-1β水平。

1.5 各组THP-1细胞p-AKT、AKT、PPAR-γ蛋白表达检测 采用Western blotting法。将体外培养的THP-1细胞分为四组，分别以PBS(1%,500 μL)、MSU(100 μg/mL)、Piog(100 μg,500 μL)、LY294002(100 μg/mL,500 μL)逐级干预，得到PBS组、PBS+MSU组，PBS+MSU+Piog组、PBS+MSU+Piog+LY294002组，37 ℃、5%CO2继续培养16 h，弃去培养基，各组细胞加入RIPA裂解液裂解蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每组取50～100 μg蛋白，SDS-PAGE分离蛋白，电转至PVDF膜，用一抗和相应的荧光二抗孵育后，在ODYSSEY成像系统上进行曝光并记录各组细胞中p-AKT、AKT、PPAR-γ蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组IL-1β标记阳性THP-1细胞构成比比较 PBS组、T0070907组、Piog组、MSU组、MSU+T007090组、MSU+Piog组IL-1β标记阳性THP-1细胞构成比分别为(6.50±1.98)%、(10.76±1.39)%、(5.49±0.26)%、(72.56±2.73)%、(81.54±3.68)%、(10.80±2.26)%，与其他组比较，MSU组、MSU+T0070907组IL-1β标记阳性THP-1细胞构成比升高(P均<0.05)。PBS组、T0070907组、Piog组IL-1β标记阳性THP-1细胞构成比差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 各组THP-1细胞上清液IL-1β水平比较 PBS组、T0070907组、Piog组、MSU组、MSU+ T007090组、MSU+Piog组THP-1细胞上清液IL-1β水平分别为(94.65±2.49)、(161.00±13.75)、(56.87±7.82)、(214.49±26.48)、(402.43±3.18)、(129.57±8.19)pg/mL。六组THP-1细胞上清液IL-1β水平差异有统计学意义(P<0.05)。MSU组、MSU+T0070907组IL-1β水平较PBS组、T0070907组、Piog组明显升高，而MSU+Piog组较MSU组、MSU+T0070907组下降(P均<0.05)。

2.3 各组THP-1细胞p-AKT、AKT、PPAR-γ蛋白表达比较 PBS、PBS+MSU、PBS+MSU+Piog 、PBS+MSU+Piog+LY294002组p-AKT蛋白相对表达量分别为70.12±2.11、312.23±16.12、671.54±34.32、121.32±15.64；AKT蛋白相对表达量分别为123.14±8.92、243.32±15.86、435.15±43.56、116.26±7.86；PPAR-γ蛋白相对表达量分别为213.21±6.35、365.32±7.92、467.64±8.65、307.35±6.82；四组THP-1细胞p-AKT、AKT、PPAR-γ蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨论

高尿酸血症是痛风发病的基础，随着血尿酸升高，过饱和的MSU沉积在关节及组织，引起关节的急性炎症反应，出现剧烈疼痛以及皮肤红肿[8]。在急性痛风性关节炎发生发展过程中，各种炎症细胞及细胞因子相互协同、诱生，伴随炎症过程始终[9]。沉积的MSU可趋化白细胞，白细胞吞噬MSU后迅速释放白三烯和糖蛋白趋化因子，均成为痛风炎症反应的重要介质。而单核巨噬细胞受MSU刺激后释放白细胞介素，如IL-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，均可加重痛风的炎症反应。其中IL-1β是介导炎症反应重要的炎症因子[10]。IL-1β可激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤作用。在滑膜、软骨、关节滑液中均发现IL-1β的活性形式，被认为是炎症调节的始动因素，亦是最经典的炎症调节剂[11]。IL-1β还可刺激单核/巨噬细胞等合成IL-6[12]。本研究证实，MSU刺激THP-1细胞后，IL-1β水平明显升高。

PPAR-γ在组织中分布很广，最早发现在大肠、脂肪组织中表达[13]。随后发现，PPAR-γ在血管平滑肌细胞、泡沫细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞及肿瘤病灶中均异常表达[14]。在糖尿病模型大鼠中，吡格列酮可减少尿白蛋白的排泄，同时抑制巨噬细胞的浸润和NF-κB活性等，进而减轻糖尿病肾病的组织病理学损害[15]。

本研究通过体外培养THP-1细胞，用MSU刺激细胞，并分别加入PPAR-γ激动剂吡格列酮及PPAR-γ抑制剂T0070907，证实吡格列酮可致炎症因子IL-1β水平下降，而抑制PPAR-γ活性后，IL-1β水平又明显升高，证实吡格列酮可减轻MSU诱导体外细胞的炎症反应。然而吡格列酮发挥抗炎作用的具体机制目前尚不明确。

AKT是一种相对分子质量为57 kD的丝/苏氨酸蛋白激酶，可被多种物质活化。AKT通过影响下游多种效应分子的活化状态，发挥调节细胞存活、代谢、增殖作用。丁宝龙等[16]发现，吡格列酮可通过上调p-AKT的表达保护缺血再灌注的心肌细胞。本研究发现，吡格列酮干预后，PPAR-γ和p-AKT水平均明显升高。体外研究亦证实，吡格列酮可上调THP-1细胞中PPAR-γ、AKT、p-AKT水平，当加入AKT抑制剂LY294002后，随着AKT、p-AKT水平下降，PPAR-γ水平明显下降，说明吡格列酮通过激活AKT途径发挥抗炎作用。

综上所述，PPAR-γ激动剂吡格列酮能有效抑制MSU诱导THP-1细胞的炎症反应，其机制可能通过活化PPAR-γ/AKT通路实现。