NDUFA4L2在肾透明细胞癌组织与外周血中的表达及意义

韩静,董志红,蒲艳,宋建忠,张萌萌,柳惠斌

(1新疆医科大学附属肿瘤医院肿瘤防治研究所,乌鲁木齐830011；2新疆医科大学附属肿瘤医院)

肾透明细胞癌(ccRCC)是肾细胞癌中最常见的组织学亚型，占全部肾细胞癌的65%～70%[1]。目前，肾癌最有效的治疗手段仍以手术为主。然而，肾癌发病隐匿，早期无特异的临床症状和体征，患者确诊时多已出现局部复发或远处转移，失去手术治疗的机会[2～4]。迄今为止，肾癌仍缺乏一种如前列腺特异性抗原(PSA)对前列腺癌[5]、甲胎蛋白对原发性肝癌[6]那样简易、非侵袭性的早期诊断和治疗随访生物标志物，这是肾癌研究领域的一个重大难题。NDUFA4L2 是线粒体复合物1的一种负性调节因子，已被鉴定为缺氧诱导因子的靶基因并定位于线粒体[7]。应用mRNA微阵列技术分析发现，NDUFA4L2在VHL缺陷型细胞系、肿瘤细胞、缺氧和类风湿关节炎等病理生理条件下的神经母细胞瘤细胞中均呈现过表达[8～11]。有研究显示，NDUFA4L2在ccRCC组织中表达增高，可作为肾癌诊断的新型标志物[12]。然而，目前尚未见到有关NDUFA4L2 在肾癌患者外周血中表达及其与肾癌发病风险关系的报道。本研究旨在通过检测ccRCC组织及外周血中NDUFA4L2的表达，分析NDUFA4L2与患者临床病理特征的相关性，探讨其临床诊断价值，评价其作为肾癌相关肿瘤标志物的潜力。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年1月～2018年9月于新疆医科大学附属肿瘤医院泌尿外科就诊的72例ccRCC患者手术切除的肿瘤组织及相应癌旁组织(距离癌组织3 cm)。患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗，排除伴发器质性或系统性疾病，如糖尿病、高血压等，及合并其他肿瘤者。其中男47例、女25例，年龄35～80岁，中位年龄50岁。ccRCC的临床诊断依据为术后组织病理检查。另收集同期相同入组标准的102例ccRCC患者术前的静脉血液标本作为肾癌组，以同期于新疆医科大学附属肿瘤医院体检中心体检的无肿瘤病史的68例健康体检者的静脉血液标本作为对照组。对照组标本收集前排除高血压、糖尿病等全身性疾病，现阶段无任何部位的细胞恶变。ccRCC的临床诊断依据为术后组织病理检查。其中肾癌组男61例、女41例，年龄32～82岁，中位年龄54岁(≤60岁72例，>60岁30例)；对照组男38例、女30例，年龄30～81岁，中位年龄56岁(≤60岁41例，>60岁27例)。两组性别及年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。本研究已通过新疆医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 肿瘤组织及相应癌旁组织中NDUFA4L2表达检测 肾癌组织及其相应癌旁组织标本切下后迅速放入液氮中冷冻，并置于-80 ℃冰箱备用；采用RT-PCR法检测肿瘤组织中NDUFA4L2表达，按照PrimeScriptTMRT Ⅱ逆转录试剂盒、SYBRPremix Ex Taq Ⅱ扩增试剂盒 说明书要求，组织RNA提取试剂TRIzol提取组织总RNA，反转录获得cDNA。内参GAPDH及NDUFA4L2引物由Primer5软件进行设计，经BLAST比对后由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：GAPDH正向引物：5′-TGACTTCAACAGCAGCACCCA-3′,反向引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；NDUFA4L2正向引物：5′-ACGATATGGCAGGAGCCAGT-3′,反向引物：5′-CAGGCAGATTAAGCCGATCA-3′。应用实时定量PCR扩增仪(ABI 7500)检测每个扩增循环后SYBR Green荧光信号水平，20 μL反应体系，反应条件：预变性95 ℃ 15 s后，进行40个循环反应：95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 运用溶解曲线检测扩增产物纯度。每个样本重复3次。NDUFA4L2的2ΔCt值代表肾癌组织及癌旁组织中NDUFA4L2表达与内参基因表达水平的相对倍数关系。2-ΔΔCt值越大表示NDUFA4L2在肿瘤组织中表达越显著。

1.3 外周血NDUFA4L2的检测 收集ccRCC患者手术前及健康体检者外周血标本5 mL，置于BD静脉真空采血管(PreAnalytiX, 瑞士)，采血后，立即颠倒采血管10～20 次，使之与RNA保护液充分混合，室温静置2 h, 转移到4 ℃放置6 h或过夜，再转移至-20 ℃放置6 h或过夜，最后转移至-80 ℃长期保存。采用RT-PCR法检测外周血中NDUFA4L2表达，按全血RNA提取试剂盒说明书要求，提取外周血总RNA，反转录获得cDNA。内参GAPDH及NDUFA4L2引物由Primer5软件进行设计，经BLAST比对后由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：GAPDH正向引物：5′-TGACTTCAACAGCAGCACCCA-3′,反向引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；NDUFA4L2正向引物：5′-ACGATATGGCAGGAGCCAGT-3′,反向引物：5′-CAGGCAGATTAAGCCGATCA-3′。应用实时定量PCR扩增仪(ABI 7500)检测每个扩增循环后SYBR Green荧光信号水平，20 μL反应体系，反应条件：预变性95 ℃ 15 s后，进行40个循环反应：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s, 运用溶解曲线检测扩增产物纯度。每个样本重复3次。根据RT-PCR数据计算出的2ΔCt值代表NDUFA4L2与内参基因表达水平的相对倍数关系，2-ΔΔCt值越大表示NDUFA4L2水平越高。

2 结果

2.1 外周血NDUFA4L2表达及与患者临床病理特征的关系 肾癌组与对照组外周血NDUFA4L2的相对表达量分别为0.304 ±0.148、0.160±0.045，两组相比差异有统计学意义 (P<0.01)。外周血中NDUFA4L2表达与TNM分期和Fuhrman分级有关(P均<0.05)，而与患者年龄、性别、肿瘤直径等无关(P均<0.05)，见表1。

表1 外周血NDUFA4L2表达与ccRCC患者临床病理特征的关系

2.2 ccRCC组织中NDUFA4L2表达与患者临床病理特征的关系 ccRCC组织及其相应癌旁组织中NDUFA4L2的相对表达量分别为1.20±0.41、0.45±0.12，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。NDUFA4L2表达与ccRCC TNM分期和Fuhrman分级相关(P均<0.05)，而与患者年龄、性别、肿瘤直径等无关(P均<0.05)，见表2。

2.3 外周血NDUFA4L2在ccRCC诊断中的价值 外周血NDUFA4L2诊断ccRCC绘制的ROC曲线下面积 (AUC)为0.876 (95%CI：0.816～0.933,P<0.01) 。根据 ROC曲线的坐标值计算Youden指数 (灵敏度+特异度-1) 确定诊断界值。当诊断界值为0.235时，其灵敏度为81.4%，特异度为91.2%。外周血NDUFA4L2诊断TNM Ⅰ～Ⅱ期ccRCC的AUC为0.817 (95%CI：0.718～0.917,P<0.01)，灵敏度为85.3%，特异度为61.8%。

表2 ccRCC组织中NDUFA4L2表达与患者临床病理特征的关系

3 讨论

目前，超过50%的肾癌是通过非针对性的影像学检查偶然发现的，早期局限性肾癌和局部进展性肾癌主要治疗手段为手术切除，但40%～50%的局限性肾癌患者即使手术后仍可继发转移[13,14]。当前，提高肾癌疗效的关键在于早期确诊、早期治疗。但迄今为止肾癌仍缺乏一种简易、非侵袭性的早期诊断和治疗随访生物标志物。因此，加强肾癌的基础研究，发现新的早期诊断和预警生物标志物对提高肾癌的疗效有重要意义。

已有研究证实，NDUFA4L2在ccRCC组织中呈高表达，其表达随AJCC分期进展而增加。NDUFA4L2可能通过与多个肿瘤相关蛋白相互作用调控肿瘤细胞的生长与死亡进程[15]。NDUFA4L2过表达在ccRCC中有重要意义，可作为独立的危险因子影响肾癌患者预后，是ccRCC潜在的治疗靶点[16]。李雪峰等[12]通过生物信息学分析发现，NDUFA4L2基因在ccRCC组织中的表达高于配对的癌旁组织，ROC曲线提示组织中NDUFA4L2的表达对ccRCC有良好的诊断价值。上述研究表明，NDUFA4L2不仅是ccRCC病理生理进程中关键的功能基因，还可能是一种优良的肿瘤标志物。

本研究结果显示，无论在癌组织还是肾癌患者外周血，NDUFA4L2表达水平均升高且与疾病分期及Fuhrman分级相关。根据外周血NDUFA4L2表达水平绘制的ROC曲线结果显示，NDUFA4L2诊断ccRCC的AUC为0.876,在ccRCC诊断中表现出较高的灵敏度和特异度。另外，NDUFA4L2在早期ccRCC诊断中亦显示良好的诊断价值，有望通过检测外周血中NDUFA4L2的水平筛查出更多的早期肿瘤患者，有助于改善预后。鉴于目前ccRCC诊断尚缺乏微创、灵敏度及特异度高的生物标志物，本研究提示外周血NDUFA4L2作为ccRCC患者诊断的新型潜在循环肿瘤标志物可能具有较高的临床应用价值和前景。后期，我们将扩大样本量进行验证，进一步明确NDUFA4L2的临床转化价值。