急性脑梗死患者血清let-7f、IL-6的水平变化及意义

唐国富，李志远，马可，吕华东，庞文军

(1钦州市第一人民医院，广西钦州 535000；2南宁市红十字会医院)

急性脑梗死是指多种原因引发脑组织血供突然减少或停止，组织缺血、缺氧并发生软化和坏死所致的脑血管疾病，常伴有不同程度的神经功能缺损，重者可终身残疾甚至死亡，该病多发于中老年人，近年来发病呈年轻化趋势[1,2]。早期发现并及时评估急性脑梗死病情严重程度，对临床制定针对性治疗方案及改善患者预后有重要价值。颈动脉粥样硬化斑块是急性脑梗死的重要病理基础，斑块不稳定破裂后阻塞血管并形成血栓栓塞，最终导致动脉血流量减少而致急性脑梗死[3]。炎性细胞因子与颈动脉粥样硬化发生发展相关，白细胞介素-6(IL-6)是由血管内皮细胞及活化的T细胞等分泌的促炎因子，研究证实[4]，IL-6通过引起炎症级联反应而介导动脉粥样硬化过程。微小RNA(miRNA)是长度为17～25个核苷酸的小分子非编码RNA，研究[5]表明，miRNA特异结合mRNA的3′UTR端，通过抑制miRNA的翻译或使其加速降解而调控下游靶基因。Let-7f属miRNA家族成员，通过调控血管内皮功能而在急性心肌梗死过程中发挥作用[6]，Let-7f表达异常还介导了恶性肿瘤的发生发展[7,8]。关于Let-7f、IL-6联合检测与急性脑梗死的关系，目前相关研究尚不多。2017年3月～2019年3月，我们观察了急性脑梗死患者血清let-7f、IL-6水平变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2017年3月～2019年3月经钦州市第一人民医院神经内科诊治为急性脑梗死的109例患者为病例组，纳入标准：①发病突然，典型临床表现包括头痛、眩晕、耳鸣、半身不遂等，常伴有恶心呕吐，严重者快速昏迷；②经头部CT、MRI检查、实验室检查等确诊为急性脑梗死，并符合中国急性缺血性卒中诊治指南(2014年)[9]中急性脑梗死诊断标准；③首次发病，且发病至入院时间<3 d；④年龄≥18岁；⑤获得医院伦理委员会的批准；⑥患者家属知情同意，并在知情同意书上签字。排除标准：①孕产妇及哺乳期女性；②心脏功能不全者；③肝、肾功能障碍者；④既往有脑梗死病史者；⑤急、慢性炎症性疾病患者；⑥自身免疫性疾病患者；⑦近2个月内有外伤史或接受过重大手术治疗患者；⑧恶性肿瘤患者；⑨其他可能影响本研究结果的疾病患者；⑩入组前1个月内接受过类固醇激素或抗炎药治疗者。根据颈动脉内膜中膜厚度(IMT)[10]将患者分为颈动脉正常组(IMT<1.2 mm且颈动脉内膜光滑完整)共51例，颈动脉斑块组(IMT≥1.2 mm)共58例。其中颈动脉斑块组又分为稳定性斑块组(n=32)和不稳定性斑块组(n=26)。颈动脉正常组男27例、女24例，年龄(63.28±5.19)岁，BMI(23.24±2.57)kg/m2，高血压22例，糖尿病15例，有饮酒史16例，空腹血糖(5.77±0.79)mmol/L，甘油三酯(TG)为(1.52±0.27)mmol/L，总胆固醇(TC)为(4.51±0.56)mmol/L，高密度脂蛋白(HDL-C)为(1.03±0.34)mmol/L，低密度脂蛋白(LDL-C)为(3.26±0.64)mmol/L。不稳定性斑块组男17例、女15例，年龄(64.07±4.96)岁，BMI(22.57±2.81)kg/m2。高血压17例，糖尿病11例，有饮酒史10例，空腹血糖(5.86±0.72)mmol/L，TG为(1.39±0.34)mmol/L，TC为(4.62±0.50)mmol/L，HDL-C为(0.99±0.31)mmol/L，LDL-C为(3.21±0.59)mmol/L。不稳定性斑块组男15例、女11例，年龄(63.28±5.11)岁，BMI(23.06±2.77)kg/m2，高血压16例，糖尿病9例，有饮酒史9例，空腹血糖(5.69±0.80)mmol/L，TG为(1.59±0.39)mmol/L，TC为(4.49±0.52)mmol/L，HDL-C为(1.04±0.30)mmol/L，LDL-C为(3.30±0.62)mmol/L。随机选取同期于我院体检中心查体健康的60例体检者为对照组，近2个月内无外伤史，同时未进行过重大手术治疗，无其他可能影响本研究的疾病。对照组男37例、女23例，年龄(62.97±5.82)岁，BMI(23.10±2.34)kg/m2，高血压14例，糖尿病7例，有饮酒史19例，空腹血糖(5.73±0.76)mmol/L，TG为(1.46±0.32)mmol/L，TC为(4.56±0.67)mmol/L，HDL-C为(1.17±0.28)mmol/L，LDL-C为(2.96±0.55)mmol/L。四组性别、年龄、BMI、饮酒史、空腹血糖、TG、TC比较，差异无统计学意义(P均>0.05)，与对照组比较，病例组高血压史、糖尿病史比例较高，血清HDL-C水平降低，血清LDL-C水平升高，差异有统计学意义(P均<0.05)。

1.2 血清IL-6检测 收集病例组患者入院次日清晨空腹肘静脉血5 mL，健康体检者于体检当日抽取，将血液标本于非抗凝管中静置5 min，3 000 r/min，离心10 min，离心半径为12 cm，留取上清液置于-80 ℃环境下保存，留待检测。采用酶联免疫吸附法检测血清IL-6，酶联免疫试剂盒购自上海佳和生物科技有限公司，检测过程严格按照试剂盒上的说明进行。

1.3 血清Let-7f mRNA检测 提取RNA：将TRIzol试剂(上海闪晶分子生物科技有限公司)以1∶1加入到3 mL血清标本中，混匀后以苯酚/氯仿去除蛋白质后加入0.5 mL的乙醇沉淀RNA，并将焦炭酸二乙酯(DEPC)加入其中溶解，根据紫外分光光度法对总RNA进行提取，提取OD260/OD280≥1.8的RNA，在低温环境下保存。RNA试剂盒购自北京康为公司。

cDNA合成：按照RevertAidr First strand cDNA Synthesei试剂盒的说明合成cRNA，反应体系：1 μL/Conc的总RNA，1 μL的5×miScript RT Buffer，1 μL的miScript Reverse Transcriptase Mix，加H2O直至20 μL体积，在RT反应体系中混匀后进行孵育反转录，温度为40 ℃，持续60 min，然后孵育灭火反转录酶，温度为90 ℃，持续10 min。

RT-qPCR反应：在去RNase的PCR管中加入适量cDNA，并在其中加入正反向引物，按照试剂盒上的相关说明操作。let-7f mRNA正向引物：5′-GTTTACCTGAAGAGCTCTGGTAC-3′，反向引物：5′-CCTTATCTGCTAGTGTCGACATCAT-3′，长度为249 kb，β-actin为内参基因，正向引物：5′-TGACGAGACCTCTATGCCGACTC-3′，反向引物：5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，长度为265 kb。建立10 μL的反应体系：5 μL的2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer，0.4 μL的10 μmol/L的Forward primer，0.4 μL的10 μmol/L的Reverse primer，0.2 μL的SuperEnzyme Mix，0.6 μL的RNA Template，3.4 μL的Rnase-Free Water。反应条件：预变性，95 ℃持续10 min，循环40次；变性，95 ℃持续30 s；退火，56 ℃持续20 s；延伸，72 ℃持续40 s，收集荧光信号。let-7f mRNA的相对表达量采用2-ΔΔCT表示，所有样本重复3次，其中ΔCT=(let-7f平均CT)-(β-actin平均CT)，ΔΔCT为(let-7f的ΔCT)-(校准标本ΔCT)，CT为荧光信号在每个PCR管内到达设定阈值的循环数。

2 结果

2.1 各组血清IL-6、let-7f mRNA水平比较 颈动脉正常组、稳定性斑块组、不稳定性斑块组、对照组血清IL-6水平分别为(57.78±28.56)、(96.22±29.18)、(137.29±25.43)、(16.51±27.30)ng/L，四组血清IL-6水平比较差异有统计学意义(F=133.853，P=0.000)。病例组血清IL-6水平高于对照组，并且斑块越不稳定，血清IL-6水平越高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。颈动脉正常组、稳定性斑块组、不稳定性斑块组、对照组血清let-7f mRNA相对表达量分别为1.32±0.41、0.98±0.44、0.61±0.39、2.24±0.45，四组血清let-7f mRNA相对表达量比较差异有统计学意义(F=116.054，P=0.000)。病例组血清let-7f mRNA相对表达量低于对照组，且斑块越不稳定，血清let-7f mRNA表达下调越显著，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.2 急性脑梗死患者血清let-7f mRNA、IL-6水平与颈动脉斑块稳定性的关系 秩相关分析结果显示，急性脑梗死患者血清let-7f mRNA与斑块稳定性呈正相关(rs=0.638，P<0.05)，血清IL-6与斑块稳定性呈负相关(rs=-0.609，P<0.05)。此外，let-7f mRNA与IL-6呈负相关(rs=-0.712，P<0.05)。

2.3 血清let-7f mRNA、IL-6对急性脑梗死的诊断价值 let-7f mRNA诊断急性脑梗死的ROC曲线下面积(AUC)为0.830(95%CI：0.748～0.913)，约登指数为0.671，此时最佳截断值为0.922，灵敏度、特异度分别为0.83、0.77，准确性为0.82；IL-6诊断急性脑梗死ROC的AUC为0.812(95%CI：0.726～0.899)，约登指数为0.598，此时最佳截断值为68.37 ng/L，灵敏度、特异度分别为0.80、0.72，准确性为0.75；两指标联合诊断急性脑梗死的AUC为0.903(95%CI：0.840～0.966)，灵敏度、特异度分别为0.89、0.82，准确性为0.87。见图1。

图1 血清lef-7f mRNA、IL-6诊断急性脑梗死的ROC曲线

3 讨论

miRNA是广泛存在于真核生物中的内源性单链小分子RNA，在人体中特异度表达并稳定存在，主要参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程[11]，miRNA还具有致癌和抑癌作用，参与肝癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的发生发展[12,13]。let-7家族成员主要包括let-7a、let-7f、miRNA-98等，是常见的一类miRNA。Ge等[14]研究显示，let-7f mRNA在肝癌患者中表达下调，且与患者临床病理特征密切相关。研究还显示[15]，Let-7f过表达可抑制Blimp-q表达，导致TNF-α、IFN-γ、IL-6等炎性细胞因子释放，加重炎症反应，在小鼠体内敲除let-7f基因可促进Blimp的表达，减轻炎症反应。此外，let-7f对血管内皮细胞增殖、分化具有抑制功能，通过趋化中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞等促进炎症因子释放[16,17]。Lin等[18]发现，动脉粥样硬化形成过程中，let-7f表达下调导致炎性因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)及血小板源性生长因子(PDGF)等水平升高，同时引起细胞外基质(EMC)沉淀，最终促进动脉粥样斑块形成，引起斑块破裂等。IL-6是由单核细胞以及内皮细胞等合成并分泌的具有多种生物学功能的炎性因子。研究发现[19]，IL-6分泌使血脑屏障破坏增加，自由基形成及兴奋性氨基酸释放，加速凝血和血栓形成，堵塞血管，形成动脉粥样硬化，IL-6还能介导凝血因子合成而影响氧化型低密度脂蛋白摄入，参与动脉粥样硬化过程。可见，let-7f和IL-6在炎症反应介导的动脉粥样硬化过程中有重要作用。

本研究纳入的急性脑梗死患者与健康体检者相比，高血压和糖尿病患者占比较高，且HDL-C降低和LDL-C升高。大量研究已表明，高血压、糖尿病是引起动脉血管硬化的独立危险因素[20]，而血脂异常与急性脑梗死密切相关，定期监测血脂指标对预防脑血管病有积极意义[21]。本研究结果显示，病例组血清let-7f mRNA相对表达量低于对照组，血清IL-6水平高于对照组，提示血清let-7f mRNA表达下调，IL-6水平升高可能参与了急性脑梗死发病过程。Let-7f mRNA下调引起细胞周期蛋白依赖性激酶的活性增加而使细胞不断增殖分化，导致血管内壁增厚和管腔变狭窄，血供减少；低表达的let-7f mRNA使血管内皮细胞结构破坏而暴露内部的胶原组织并释放组织因子，使血小板聚集于表面，凝血反应链激活刺激并增加免疫球蛋白、纤维蛋白含量；let-7f mRNA表达降低还参与调控细胞的趋化作用和定向性转移，使中性粒细胞、淋巴细胞、上皮细胞及内皮细胞的趋化因子受体激活而使血液处于高凝及纤溶亢进状态，并增加血液的黏滞性及凝固性，形成血栓前状态，上述机制最终诱发急性脑梗死[22]。IL-6可通过激活补体系统、凝血系统，诱导生物活性物质如组胺、激肽等合成和释放，引起机体微循环障碍，血液处于高凝状态，血栓形成，参与急性脑梗死的发生发展[22]；IL-6还能介导高敏C-反应蛋白的释放而参与动脉粥样硬化形成，并最终引发急性脑梗死。

进一步分析显示，急性脑梗死患者血清let-7f mRNA与颈动脉斑块稳定性呈负相关，即let-7f mRNA表达越低，斑块稳定性越差，可能与let-7f mRNA表达越低，血管内皮细胞增殖分化越明显，炎性细胞趋化作用越强，由此导致的炎性细胞因子浓度越高，更多的血小板附着、聚集，越易形成动脉粥样硬化斑块并使其不稳定甚至破裂。此外，血清IL-6与斑块稳定性呈负相关，即IL-6水平越高，颈动脉斑块稳定性越差，可能是因持续的炎症反应引起白细胞和血小板过量聚集，并不断释放炎症介质使血管壁稳态破坏，引起纤维冒溃疡及斑块破裂。结果还发现血清let-7f mRNA与IL-6呈负相关性，同时两者通过相互作用共同介导颈动脉斑块的破裂而诱发急性脑梗死。其机制可能与let-7f mRNA与炎症反应密切有关，let-7f mRNA表达下调可抑制Blimp-q表达，提高促炎因子如IL-6的释放。血清let-7f mRNA、IL-6诊断急性脑梗死具有较大价值，两者的AUC分别为0.830、0.812，灵敏度、特异度相近，分别为0.83、0.77和0.80、0.72，两指标联合检测的AUC为0.903，灵敏度、特异度为0.89、0.82，提示二者可作为诊断急性脑梗死的重要标志物。

综上所述，血清let-7f mRNA表达下调，IL-6表达升高，二者参与了急性脑梗死的发病过程，且与颈动脉斑块形成及稳定性密切相关；二者早期联合检测有助于急性脑梗死的诊断。