甲状腺癌组织中miR-146a、LIN52 mRNA的表达变化及意义

周伟清,沈卫星,庄一心

(复旦大学附属中山医院青浦分院， 上海 201700)

甲状腺癌是内分泌系统及头颈部常见的恶性肿瘤，在女性中发病较高，发病数占全部肿瘤的1%，流行病学研究表明，近30年来，全球多数地区甲状腺癌的发病呈上升趋势[1]。目前，甲状腺癌的治疗主要以手术治疗为主，术后治疗包括甲状腺素抑制治疗、放射性碘治疗，近年来分子靶向治疗及免疫治疗亦得到快速发展。甲状腺的治疗及预后评估需根据患者的具体表现选择合适的干预方法，若借用分子生物学、表观遗传学来对甲状腺癌的全面评估可提高疾病的治疗成功率、改善患者预后[2]。微小RNA(miRNA)是一类非编码的小分子RNA，长度约为22个核苷酸，广泛存在于各种生物中，调控人体60%蛋白质编码基因的转录翻译过程[3]。同时miRNA可参与调控肿瘤的发生发展[4]。有研究证实，诸多miRNA基因簇或单个miRNA在甲状腺癌中表达异常[5]。有研究发现，在乳头状甲状腺癌中，miR-146a表达显著升高，且miR-146a表达与肿瘤侵袭力呈显著相关性，故miR-146a可作为预后不良的观察指标之一[5]。LIN52是一种转录因子配对盒，研究发现，其可在转录水平调控一系列生理活动[6]，有研究表明LIN52可能是miR-146a的调控基因之一，参与miR-146a的表达过程中[7]。2014年10月～2019年5月，我们观察了甲状腺癌组织中miR-146a、LIN52 mRNA的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年10月～2016年5月于我院确诊为甲状腺癌患者90例。纳入标准：①经病理学检查确诊患者为甲状腺癌；②患者既往经手术治疗，但未在手术前接受化疗、放疗等治疗；③临床病理及随访资料完整；④患者一般身体状况良好，Kamofsky评分≥80分。排除标准：①近3个月有创伤、手术史；②合并甲状腺功能能亢进、库欣综合征等内分泌系统疾病；③合并其他器官或系统的恶性肿瘤；④伴有严重的肝肾功能障碍。90例患者中男35例、女55例，年龄41～68(58.5±9.2)岁。伴有淋巴结转移者40例；伴有局部浸润者36例；TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期25例，Ⅲ期42例，Ⅳ期8例。病理类型：乳头状癌67例，滤泡癌13例，甲状腺髓样癌7例，未分化型甲状腺癌3例。患者自愿参加本项研究，并知情同意自愿提供癌组织切片、癌旁组织切片用于研究中数据采集等工作。所有患者自出院之日起开始进行生存期随访，每1～3个月随访1次，以门诊或电话方式随访，中位随访时间32个月，随访截止到2019年5月。

1.2 癌及癌旁组织中miR-146a及LIN52表达测定 收集患者经甲状腺全切除或次全切除术后肿瘤组织切片及距肿瘤组织切缘>2 cm的癌旁正常组织切片0.05 g，加入TRIzol 1 mL研碎成浆提取RNA后，于紫外分光光度计波长260、280 nm处检测样品吸光度值，计算样品的RNA纯度和浓度，并进行相应稀释。随后利用逆转录试剂盒中反转录酶来进行体外互补DNA(cDNA)合成过程。以合成的cDNA为模板，按如下反应条件和反应体积检测miRNA-146a 和LIN52 mRNA相对表达。反应条件：DNA变性，95 ℃ 30 s；引物退火：60 ℃ 30 s，引物延伸72 ℃ 4 min；进行40 个循环。20 μL PCR 反应总体积包括：10 μL 2×SYBR Premix ExTaq，0.5 μL正反向引物，1 μL cDNA 模板和8 μL ddH2O。每份样品均检测3 次，以U6 为内参，使用2-△△Ct法计算甲状腺癌及癌旁组织中miRNA-146a、LIN52的相对表达量。U6 正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miRNA- 146a 正向引物：5′-TGTTGCTGAAGAGCTCTGGTAC-3′，反向引物：5′-TCGTCTGATGATGTCGAATGTAC-3′；LIN52正向引物：5′-GTTTACCTGAAGAGCTCTGGTAC-3′，反向引物：5′-CCTTATCTGCTAGTGTCGACATCAT-3′。

2 结果

2.1 甲状腺癌及癌旁组织中miRNA-146a、LIN52 mRNA 表达比较 甲状腺癌患者癌及癌旁组织中miR-146a相对表达量分别为1.22±0.26、0.65±0.11，二者比较差异有统计学意义(t=19.154，P<0.05)。甲状腺癌患者癌及癌旁组织中LIN52 mRNA相对表达量分别为0.68±0.17、1.48±0.30，二者比较差异有统计学意义(t=15.570，P<0.05)。

2.2 miRNA-146a及LIN52 mRNA表达与癌症患者临床病理特征的关系 癌组织中miRNA-146a及LIN52 mRNA相对表达量与淋巴结转移、TNM分期、局部浸润有关(P均<0.05)，与患者的性别、年龄、病理类型无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 癌组织中miR-146a与LIN52表达的关系 癌组织中miR-146a与LIN52表达呈负相关(r=-0.611,P=0.009)。

2.4 miR-146a、LIN52 mRNA表达与甲状腺癌患者预后的关系 患者获随访1～36个月，中位随访时间32个月，无失访病例，死亡25例。以甲状腺癌组织中miR-146a mRNA相对表达量的平均数0.65为临界值，分为miR-146a高表达组43例，miR-146a低表达组47例。miR-146a高表达组3年生存率为86.05%(37/43)，miR-146a低表达组3年生存率为59.57%(28/47)，miR-146a高表达组的3年生存率高于miR-146a低表达组(χ2=7.844，P=0.005)。以LIN52 mRNA相对表达量的平均数1.48为临界值，分为LIN52高表达组46例和LIN52低表达组44例。LIN52高表达组3年生存率为60.87%(28/46)，LIN52低表达组3年生存率为84.09%(37/44)，LIN52高表达组3年生存率低于LIN52低表达组(χ2=6.045，P=0.014)。

表1 miR-146a、LIN52表达与甲状腺癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

甲状腺癌即使根治性手术后仍有较高的复发风险，预后较差。肿瘤的发生发展伴有癌基因的激活和抑癌基因的失活，进而导致丝裂原激活的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶等多条信号传导通路的活化，导致下游靶基因，如血管内皮生长因子等的过表达，促进肿瘤细胞增殖及血管生成等生物学过程，促进肿瘤的发生发展。以往认为非编码RNA(ncRNA)是转录过程中的“分子垃圾”，而近年来发现，ncRNA能通过影响基因的转录、翻译、翻译后修饰等基因表达的各个阶段，调控细胞的增殖、分化、衰老及自噬等生物学行为[8]。

miRNA具有19～25个碱基的ncRNA，可与mRNA 3′端非编码区(3′UTR)相结合来调控多种基因的mRNA表达。miRNA基因通常由RNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ)进行转录，初步产物为具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的初级转录miRNA(pri-miRNA)，随后pri-miRNA在细胞质中被核酸内切酶(Dicer)进一步切割，产生成熟miRNA。多种miRNA在肿瘤中均存在表达异常(升高或降低)的现象，形成复杂的RNA调控网络，参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润、转移及血管生成等生物学过程[9,10]。miR-146a是miR-146家族中的一员，人类miR-146a基因定位于第五号染色体LOC285628基因的第二个外显子区 (Chr.5q34)上[11]。研究表明，miR-146a能结合锌离子相关RhoA蛋白1(ROCK1)、乳腺癌转移抑制基因1(BRMS1)等多种靶基因的信使RNA，在转录后水平调控原癌基因表达[12,13]，而在前列腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、口腔癌等多种肿瘤组织中miR-146a表达降低[14,15]，导致ROCK1等癌基因的过度活化。本研究结果发现，甲状腺癌组织中miR-146a 相对表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义，可能原因是在肿瘤生长中发生甲基化、乙酰化导致基因表达下降有关，趋化DNA甲基转移酶1通过发挥DNA甲基化的作用，增加miR-146a甲基化以抑制其基因表达，从而促进肿瘤的发生发展[16]。甲状腺癌组织中miR-146a相对表达量与患者淋巴结转移、TNM分期、局部浸润有关。表明miR-146a影响甲状腺癌的发生发展，miR-146a表达降低后，导致PI3K-AKT-mTOR 信号通路激活，通过下游癌基因促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡，导致肿瘤分期升高。此外，基质金属蛋白酶等因子表达增加，促进细胞外基质降解，导致肿瘤细胞的局部浸润增加，而血管内皮生长因子促进淋巴管新生，肿瘤易发生淋巴结转移[17]。miR-146a高表达组3年生存率高于miR-146a低表达组，表明miR-146a是影响患者预后的关键因素之一，可作为不良预后的生物标志物。

LIN52基因属于合成多样性(synMuv)家族成员之一，synMuv 家族包括A类和B类基因，A类包括LIN-8、LIN-15A、LIN-38和LIN-56，而B类包括LIN-9、LIN-15B、LIN-35、LIN-36、LIN- 37、LIN-51、LIN-52、LIN-53、LIN-54和LIN-55。研究表明，synMuv家族成员能编码产生相应蛋白，激活受体酪氨酸激酶/RAS信号通路的信号传导，通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡等机制，促进肿瘤的进展[18]。本研究结果表明，甲状腺癌患者癌组织中LIN52 mRNA相对表达量高于癌旁组织，其机制可能与miRNA对LIN52的转录后调控有关。有研究表明，miR-146a能结合LIN52信使RNA的3′UTR，并降低LIN52信使RNA的稳定性，抑制其表达，而肿瘤发生时miR-146a表达降低，导致LIN52表达升高[19]。本研究中，甲状腺癌组织中miR-146a与LIN52表达呈负相关，可能与miR-146a对LIN52信使RNA表达的调控作用有关[20]。此外，本研究发现患者LIN52表达与淋巴结转移、TNM分期、局部浸润有关。其原因一方面是LIN52的表达影响细胞周期激酶的活性，减少G0/G1期阻滞，促进肿瘤细胞的增殖，导致肿瘤TNM分期升高[21]。另一方面，肿瘤细胞LIN52表达升高时，可通过抑制转录因子E2F的表达，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，导致上皮性表型E钙黏素表达减少，肿瘤细胞易发生局部浸润和淋巴转移[22,23]。本研究中，LIN52高表达组3年生存率低于LIN52低表达组，差异有统计学意义，说明LIN52在肿瘤生长过程中发挥促癌作用，LIN52低表达的患者可以获得良好预后。

综上所述，甲状腺癌组织中miR-146a表达降低，LIN52表达升高，两者的表达与肿瘤转移、肿瘤分期、浸润程度有关；miR-146a和LIN52参与甲状腺癌的发生发展，有望成为甲状腺癌预后新的生物学靶点。