子痫前期孕妇血清及胎盘组织中色素上皮衍生因子、血管内皮生长因子蛋白的表达变化

黄淑晖，陈小青，谢小花，章琦，徐爽

(江西省妇幼保健院，南昌330006)

子痫前期是妊娠期特发之一疾病，发病率为2%～8%[1]，血管生成因子和抗血管生成因子间的调节失衡密切相关[2,3]。血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)是血管重构过程中重要的因子。在CoCl2诱导的缺氧条件下，骨髓间充质干细胞的VEGF/PEDF显著升高，表明VEGF/PEDF平衡与新生血管形成程度密切相关[3]。VEGF降低、PEDF升高可能与子痫前期发病有关[4，5]，但VEGF、PEDF表达对子痫前期胎儿宫内发育的影响研究较少。为此，我们随机选择2015年8月～2016年8月临床确诊为子痫前期及同期正常孕妇，检测血清和胎盘组织中PEDF、VEGF蛋白表达，探讨VEGG、PEDF蛋白与子痫前期及子痫前期合并胎儿宫内生长受限(FGR)发病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取2015年8月～2016年8月于江西省妇幼保健院顺产或剖宫产分娩的子痫前期孕妇75例,纳入标准按全国高等医药院校教材《妇产科学》第7版，同期分娩的健康晚期孕妇30例为对照组。两组孕妇均为单胎，无其他内科和产科合并症，怀孕前无其他疾病，如慢性高血压、肾病、糖尿病、甲状腺功能亢进或减退、血栓或出血性疾病等。将75例子痫前期孕妇分为轻度子痫前期(MPE)组30例和重度子痫前期(SPE)组45例，其中SPE组未合并FGR 27例，合并FGR 18例。MPE组年龄(27.87±4.39)岁，身高(160.27±4.39)cm，体质量(70.57±10.06)kg，孕次(2.63±1.27)次，孕周(251.43±29.70)d。SPE组年龄(28.76±6.33)岁，身高(158.16±3.88)cm，体质量(71.74±8.65)kg，孕次(2.78±1.66)次，孕周(239.58±26.80)d。对照组年龄(27.33±3.52)岁，身高(159.90±4.03)cm，体质量(67.57±7.86)kg，孕次(2.37±1.35)次，孕周(271.42±14.17)d。三组年龄、身高、体质量、孕次比较差异无统计学意义(P>0.05)，三组间孕周逐步减小(SPE组< MPE组<对照组)，差异有统计学意义(F=14.785，P<0.05)。

1.2 血清及胎盘组织中PEDF、VEGF检测方法 收集孕妇外周静脉血4 mL，1 200 r/min离心5 min，抽取上层血清置于-80 ℃冰箱保存。ELISA法检测三组血清PEDF、VEGF，具体操作方法参照试剂盒说明书进行，VEGF、PEDF酶联免疫试剂盒购置上海卡努生物科技有限公司。在胎盘娩出后5 min内，避开出血、钙化灶，直视下取中央绒毛组织，无菌生理盐水漂洗去除血液至上清液无色后，取约1 cm×1 cm×1 cm组织2或3份，放入冻存管中-80 ℃保存。采用Western blotting法检测分娩后胎盘组织中PEDF、VEGF蛋白(VEGF抗体，bioss公司，货号bs-0279R；PEDF抗体，Bioss公司，货号bs-20784R)表达。选择正常妊娠孕妇分娩后胎盘组织15例份，SPE未合并FGR孕妇分娩后胎盘组织15例份、SPE合并FGR孕妇分娩后胎盘组织15例份，胎盘组织蛋白经8%-10%SDS-PAGE分离胶分离后，半干转印至硝酸纤维素膜上，用含5%(BSA或脱脂牛奶)的TBST室温封闭1 h，加入一抗4 ℃过夜孵育。第2天用含0.1%的TBST洗膜3次，每次5 min，加入相应的HRP标记的二抗，室温孵育1 h。0.1%TBST洗膜后，硝酸纤维素膜以 HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。β-actin作为内参对照，计算PEDF、VEGF蛋白的相对表达。所有实验至少重复3次。ECL化学发光及图像采集和分析：按照蛋白质印迹检测试剂盒说明书进行实验操作。利用凝胶成像系统(Thermo Fisher Scientific, IL, USA)采集图像和进行图像分析。

1.3 各组胎儿出生体质量、孕妇脐动脉收缩峰值流速与舒张末期血流流速之比值(S/D)测定 采用B超测定孕妇脐动脉S/D，称重记录刚出生的胎儿体质量。

2 结果

2.1 各组血清PEDF、VEGF水平比较 对照组、MPE组、SPE组血清PEDF水平分别为(2.11±1.85)、(3.93±1.52)、(5.09±2.12)μg/mL，血清VEGF水平分别为(1145.75±179.67)、(793.36±183.59)、(593.33±177.61)pg/mL，与对照组相比，MPE组及SPE组血清VEGF水平降低，对照组>MPE组>SPE组(F=84.995，P<0.05)，血清PEDF水平升高，对照组

2.2 SPE组合并FGR与未合并FGR孕妇血清PEDF、VEGF、胎儿出生体质量、孕妇脐动脉S/D值比较 SPE组未合并FGR、合并FGR者血清PEDF水平分别为(4.54±1.86)、(5.93±2.25)μg/mL，血清VEGF水平分别为(613.24±162.78)、(563.45±198.87)pg/mL，胎儿出生体质量分别为(2.55±0.77)、(1.56±0.51)kg，孕妇脐动脉S/D值分别为2.66±0.58、3.28±1.26，与SPE组未合并FGR孕妇比较，合并FGR孕妇血清PEDF水平升高，胎儿出生体质量下降，差异均有统计学意义(P均<0.05)，血清VEGF水平下降(P>0.05)；45例SPE孕妇中有5例出现脐动脉舒张期血流缺失，其中未合并FGR有2例，合并FGR有3例，其余病例中，SPE合并FGR孕妇脐动脉S/D值明显升高(P<0.05)。

2.3 孕妇胎盘组织中PEDF、VEGF蛋白表达比较 对照组分娩后胎盘组织、SPE组未合并FGR分娩后胎盘组织、SPE组合并FGR分娩后胎盘组织中均有PEDF、VEGF蛋白条带表达。见图1。对照组分娩后胎盘组织、SPE组未合并FGR分娩后胎盘组织、SPE组合并FGR分娩后胎盘组织中PEDF蛋白相对表达量分别为1.14±0.52、0.97±0.38、1.33±0.45，VEGF蛋白相对表达量分别为0.70±0.21、0.86±0.43、0.64±0.18，与对照组相比，SPE组未合并FGR和合并FGR孕妇胎盘组织中VEGF蛋白相对表达量减少，对照组SPE组未合并FGR孕妇>SPE组合并FGR孕妇(F=17.984，P<0.05)。

注：1为对照组;2为SPE组未合并FGR;3为SPE组合并FGR。

图1 胎盘组织中PEDF、VEGF蛋白表达电泳图

2.4 孕妇脐动脉S/D值、胎儿出生体质量比较 对照组、MPE组、SPE组胎儿体质量分别为(3.28±0.59)、(3.25±0.32)、(2.14±0.83)kg，与对照组相比，MPE组及SPE组胎儿出生体质量下降，对照组

3 讨论

正常胎盘血管床生成依赖于胎盘内血管生成诱导因子与抑制因子的平衡，胎盘微环境的改变能促进血管生成介质的不平衡，而此可能与不良围产结局相关。在子痫前期、胎儿生长受限、自发性流产、胎盘早剥等疾病中，均存在血管生成失衡。子痫前期患者处于抗血管生成状态，表现为抑制血管生成、对内皮有损伤作用的sFlt-1和sEng升高，VEGF与大量可溶性受体结合，而与胞膜上受体结合过程被抑制，导致血管生成处于抑制状态[1]。

VEGF 是一种自分泌和旁分泌生长因子，具有高度的保守性，能促进血管内皮细胞分裂、增殖、迁移，诱导血管新生，提高血管通透性，在维持血管内皮细胞功能及促进血管发生中有重要作用[6]。VEGF参与妊娠滋养细胞浸润、增殖和分化及胎盘血管生成、血管重构等方面。流产、子痫前期、FGR等病理情况下，VEGF表达低于正常妊娠水平[7～9]，导致出现胎盘缺血、缺氧及全身小血管痉挛等一系列变化。此外，VEGF表达降低亦会影响血管内皮细胞和滋养细胞的损伤修复，胎盘血流灌注进一步减少，加剧子痫前期病情。本研究显示，子痫前期孕妇血清VEGF水平降低，且随病情加重而进一步降低，支持以上研究结果。

PEDF是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中广泛表达的一种多功能因子，由Tombran-Tink等1989年从胎儿视网膜色素上皮细胞培养液中分离得到。研究表明，PEDF在诸多病理生理过程中发挥重要作用，具有营养和保护神经、抑制血管形成、调节血管通透性、促进肿瘤分化和凋亡功能，是目前已知最强的天然血管形成抑制剂，可显著下调VEGF表达[10,11 ]，可引起有活性的血管内皮细胞发生凋亡，从而发挥抗血管生成的作用。PEDF在女性生殖系统中高度表达，受卵巢类固醇激素调控[12]，且与卵巢过度刺激综合征、子痫前期、妊娠期糖尿病等发病有关[5,13,14]。PEDF可能是胎盘血管形成的静止因子，与VEGF之间存在一个动态的平衡，共同维持血管的稳态，一旦他们之间的平衡被打破，则会导致病理妊娠及影响胎儿发育。

本研究结果显示，与正常妊娠孕妇相比，子痫前期者胎儿体质量下降，脐动脉S/D值升高，循环VEGF表达降低，PEDF水平增加，循环PEDF/VEGF值升高，且随病情加重而升高。Wu等[5]研究表明，子痫前期患者胎盘组织中PEDF表达升高，而VEGF表达及MVD下降，且与PEDF表达呈负相关，推测PEDF可能参与子痫前期发生发展。植入性前置胎盘患者胎盘PEDF mRNA及蛋白表达明显降低，而VEGF明显升高，胎盘PEDF表达与胎盘VEGF、MVD及胎盘植入深度呈负相关[15]，笔者推测PEDF可能通过负性调节VEGF表达来抑制或逆转血管内皮的过度侵袭。体外实验证实，携带PEDF基因的腺病毒转染胎盘间充质干细胞对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移有抑制作用[16]。PEDF可通过抑制VEGF诱导VEGFR-1的磷酸化及血管内皮细胞增殖与迁移及血管渗漏，对抗VEGF的促血管生成作用，抑制血管再生，从而维持血管的静止状态和正常血管的完整性[17]。在晚孕期胎盘，PEDF还以调节VEGF的细胞内效应为靶点，通过ERK1/2和FAK的磷酸化途径，影响VEGF诱导的滋养层细胞增殖和迁移，参与限制妊娠晚期胎儿胎盘内皮细胞的生长和扩张[18]。我们将SPE组分为合并FGR及未合并FGR，分析发现合并FGR的SPE者VEGF表达进一步下降，PEDF表达及脐带S/D值进一步升高，且有5例出现脐动脉舒张期血流缺失，循环PEDF升高，Baqheri等[8]研究发现，血清VEGF水平与新生儿体质量、Apgar评分呈正相关，推测VEGF降低可能与胎儿生长发育受到抑制有关。子痫前期PEDF升高，VEGF下降，PEDF、VEGF表达失衡，血管生成因子被抑制，抗血管生成因子增加，可能影响了胎盘血管生成，从而诱发子痫前期的发生，当PEDF进一步升高，VEGF进一步下降，导致螺旋动脉痉挛，血流阻力增高，胎盘缺血、缺氧加重，影响胎儿生长发育。

综上所述，PEDF、VEGF表达异常在子痫前期及子痫前期合并FGR发病中可能起特殊作用，PEDF/VEGF平衡紊乱可能影响胎盘血管生成，加重子痫前期进程，导致出现FGR。