胃癌组织中LncRNA POU6F2-AS2的表达及意义

李理，潘兆军，梁继珍，王林

(广州市红十字会医院·暨南大学医学院附属广州红十字会医院,广州 510000)

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发展中国家较为常见，全球每年新发病例约95万，每年死亡病例约72万[1]。胃癌早期临床症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期，同时伴有局部侵袭和淋巴结转移，患者病死率较高，预后较差[2]。因而深入研究胃癌发生发展的机制，寻找新的早期诊断治疗肿瘤标志物十分必要。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA调控分子，可分为基因内LncRNA、基因间LncRNA，正义LncRNA及反义LncRNA等多种类型，在多个层次调控基因表达，如其可结合靶基因启动子区抑制基因转录、作为染色质修饰因子介导染色质重构及结合信使RNA的初级转录本抑制翻译过程等[3]。近年研究表明，LncRNA参与炎症、肿瘤、心血管疾病及自身免疫等疾病的发生发展过程[4，5]。POU6F2-AS2为LncRNA的一种，其位于7p14.1，有7个外显子，其可编码产生LncRNA POU6F2-AS2。近年研究表明，LncRNA POU6F2-AS2参与肿瘤的调控过程，如在食管癌中发现LncRNA POU6F2-AS2特异性表达升高，LncRNA POU6F2-AS2与Ybx1蛋白相互作用，调控Ybx1蛋白染色质定位，进而调控DNA损伤修复反应，促进细胞的存活[6]。本研究通过检测胃癌组织中LncRNA POU6F2-AS2表达，分析其与临床病理特征及预后的关系，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年1月～2016年1月于我院诊治的82例行手术治疗的胃癌患者。纳入标准：①患者均经术后病理检查确诊为胃腺癌；②均为初次诊治，既往未接受过放化疗等治疗；③临床病理及随访资料完整，患者及家属均知情同意并已签署知情同意书；④患者预期寿命≥10年。排除标准：①合并其他恶性肿瘤病史；②合并严重的心肺肝肾等脏器功能不全；③合并类风湿关节炎等免疫系统疾病。其中男45例、女37例，年龄25～88(58.3±7.3)岁；伴淋巴结转移38例，无淋巴结转移44例；肿瘤直径：<5 cm 47例，≥5 cm 35例；肿瘤位置：贲门胃底部16例，胃体部14例，幽门胃窦部52例；肿瘤TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期41例，Ⅳ期5例；组织学分化程度：高中分化43例，低分化39例。随访起始时间2015年1月，以门诊或电话方式随访，随访内容包括患者生存情况及疾病控制情况，无失访病例，随访终止日期为2019年1月。

1.2 胃癌组织中LncRNA POU6F2-AS2表达检测 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法对胃癌组织及癌旁(距离癌组织5 cm以上)正常胃黏膜组织中LncRNA POU6F2-AS2表达进行检测。收集术中新鲜获取的癌组织及癌旁组织，冻存管内液氮速冻，转运至实验室后置于-80 ℃冰箱保存。分别取约50 mg组织，将组织冰上研磨后加入1 mL的TRIzol试剂，应用TRIzol法提取组织中总RNA，以总RNA为模板，用反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA，分光光度计鉴定cDNA纯度，使A260/A280=1.9～2.1，-20 ℃冰箱保存待测。反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。TRIzol试剂及试剂盒均购自美国Invitrogen公司，实验步骤严格按照反转录试剂盒说明书进行。2×SYBR Green PCR Master Mix试剂盒检测LncRNA POU6F2-AS2的表达。LncRNA POU6F2-AS2正向引物：5′-CATACTGAGCACTGTCTGA-3′，反向引物：5′-CTGTGTCCAATACTCCTTCT-3′，内参基因GAPDH正向引物：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，反向引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。荧光定量PCR反应体系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，模板2 μL，加RNAase-free的双蒸水补足体系。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。所有反应于ABI7500实时定量PCR仪上完成，每个样本重复3次。采用相对Ct值方法进行数据分析，目的基因LncRNA POU6F2-AS2的相对表达量应用2-ΔΔCt法计算。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁组织中LncRNA POU6F2-AS2表达比较 胃癌组织与癌旁组织中LncRNA POU6F2-AS2相对表达量分别为1.203±0.341、0.210±0.076，胃癌组织中LncRNA POU6F2-AS2的相对表达量高于癌旁组织(t=37.178，P=0.000)。

2.2 胃癌组织中LncRNA POU6F2-AS2表达与患者临床病理特征的关系 胃癌组织中LncRNA POU6F2-AS2表达与肿瘤分期及组织学分级有关(P均<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置及是否淋巴结转移无关(P均>0.05)。肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化癌组织中LncRNA POU6F2-AS2表达分别高于肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、高中分化癌组织(P均<0.05)，见表1。

2.3 不同LncRNA POU6F2-AS2表达水平与患者生存预后的关系 患者均完成随访，随访时间2～48(32.1±6.7)个月，以胃癌组织中LncRNA POU6F2-AS2的相对表达量的中位数1.205为临界值，其中高LncRNA POU6F2-AS2表达组43例，低LncRNA POU6F2-AS2表达组39例。高LncRNA POU6F2-AS2表达组、低LncRNA POU6F2-AS2表达组3年生存率分别为34.9%(15/43)、61.5%(24/39)，两组3年生存率比较差异有统计学意义(χ2=3.974，P=0.046)，见图1。

表1 胃癌组织中POU6F2-AS2表达与患者临床病理特征的关系

图1 不同LncRNA POU6F2-AS2表达水平患者3年生存率比较

3 讨论

胃癌是常见的严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤，发病率及病死率较高。我国胃癌疾病负担重，发病和死亡病例数约占世界的50%[7]。近年来，随着胃癌研究机制的不断深入，新的分子靶向治疗、免疫治疗及联合化疗在晚期胃癌的治疗中取得良好效果[8]。因此寻找个体化、多学科联合的诊断治疗模式是胃癌诊治发展的趋势。目前胃癌的发生发展机制尚不清楚，深入研究其发病机制，有助于胃癌患者的早期诊断、治疗选择及预后判断。

基因组的非编码序列占97%，其可表达非编码RNA，以往认为是翻译过程中的“垃圾信息”，但近年来大量研究表明，非编码RNA在发育、代谢、分化及进化过程中发挥重要的调节作用[9]。根据非编码RNA核苷酸长度，可分为小的非编码RNAs(<200 nt)和长的非编码RNAs(>200 nt)。反义长链非编码RNA(AS)是从非蛋白编码基因的相反链上转录而来。LncRNA在调节生物学活动时的作用方式具有多样性，如可调节染色质重塑、转录、转录后修饰等过程，影响炎症、自身免疫及肿瘤等疾病的发生发展过程[10]。近年来研究发现，LncRNA POU6F2-AS2在恶性肿瘤中表达升高，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、抑制凋亡等生物学作用，促进肿瘤的发生发展过程，导致患者不良的临床预后[6]。本研究中，胃癌组织中LncRNA POU6F2-AS2的相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义，与以往研究报道一致[11]。目前其表达升高的机制尚不清楚，可能是胃癌肿瘤微环境中淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞等分泌产生IL-6、TNF-α等细胞因子，通过相应的细胞信号传导通路，促进肿瘤细胞LncRNA POU6F2-AS2基因的表达，导致LncRNA POU6F2-AS2基因表达增加[12,13]。此外，癌组织中LncRNA POU6F2-AS2表达与肿瘤分期、组织学分级有关，低分化、肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期癌组织中LncRNA POU6F2-AS2表达明显升高，表明癌组织中LncRNA POU6F2-AS2表达参与肿瘤的发生发展过程。其机制一方面是LncRNA POU6F2-AS2作为内源竞争性RNA能抑制下游靶基因如SOX4等的表达[14]，SOX4等转录因子表达增加能促进肿瘤细胞增殖、浸润、迁徙及黏附能力增强，促进肿瘤的远处转移[15]。另一方面，LncRNA POU6F2-AS2可能促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤的恶性进展。在宫颈癌中LncRNA HOXA11能促进上皮间质转化的关键转录因子如锌指转录因子(Snail)、E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)等的表达，促进肿瘤细胞的侵袭和浸润，而在RNA干扰LncRNA HOXA11基因表达后肿瘤细胞的侵袭和浸润能力下降[16]。胃癌发生发展过程中存在大量差异表达的LncRNA，如HOX转录反义RNA(HOTAIR)、生长特异抑制物5(GAS5)等，在胃癌中参与各自不同的调控过程[17]，因此在复杂的RNA调控网络中寻找关键的LncRNA，指导临床诊断、治疗及预后具有重要的意义。本研究中高LncRNA POU6F2-AS2表达患者3年OS明显低于低LncRNA POU6F2-AS2表达患者，表明LncRNA POU6F2-AS2有可能成为预测患者预后的生物学标志。但目前LncRNA POU6F2-AS2调控胃癌发生发展及预后的具体作用机制尚不清楚，有待进一步深入研究。

综上所述，胃癌患者癌组织中LncRNA POU6F2-AS2表达升高，检测胃癌组织中Lnc RNA POU6F2-AS2表达有助于胃癌患者的病情评估及预后判断。