奥贝胆酸联合白藜芦醇治疗非酒精性脂肪性肝病小鼠的效果观察

姜良勇，谷斌，齐亚军，殷俪宁，马伟铭，周奎臣

(1佳木斯大学，黑龙江佳木斯 154007；2佳木斯大学附属第一医院；3山东第一医科大学·山东省医学科学院)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种除乙醇因素外以肝细胞弥漫性脂肪样变和脂肪过量沉积为主要临床特征，与多种代谢紊乱相关的慢性肝脏疾病[1]。据统计，NAFLD的全球发病率为3%～5%，糖尿病和肥胖患者中20%～30%会引起脂肪性肝炎(NASH)，69%～87%会患有NAFLD[2]。NAFLD常伴有ALT、AST、TG、TC、LDL-C和HDL-C等生化指标的明显升高及B超、组织病理学的变化。NAFLD发生脂肪变性常引起NASH，继发肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)[3,4]。奥贝胆酸(OCA)是一种强效选择性法尼醇X受体(FXR)激动剂，而FXR通过间接抑制细胞色素P450家族中胆固醇7-α-羟化酶(CYP7A1)对胆汁酸合成的调节，进而抑制胆汁酸合成[5]。FXR被活化后可下调固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)表达[6]，从而减少肝脏脂肪生成。因而，OCA能显著减少肝脏脂肪变性，改善肝纤维化[7,8]，在治疗NASH方面Ⅲ期临床实验效果较好[9]。但OCA有致瘙痒及潜在致心血管疾病风险的不良反应[10,11]，研发进度受限。白藜芦醇(RSV)是一种天然的多酚类化合物，广泛存在于花生、葡萄、桑椹等植物中。RSV具有降低血小板聚集[12]，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病[13,14]等作用。研究[15,16]表明，RSV临床治疗效果较好，可通过PPARα途径、恢复溶酶体功能和自噬通量等多种机制，改善脂代谢稳态和氧化还原平衡，继而预防NAFLD。2019年3月，我们将OCA和RSV联用治疗NAFLD小鼠，以期RSV在原有疗效不变的情况下，OCA的不良作用能得到改善或消除，治疗NAFLD的同时能降低血脂，保护心脑血管。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级C57BL/6Cnc小鼠37只，雄性，体质量19～22 g，日龄42～62 d，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物使用许可证号为SCXK (京) 2016-0006]。实验药品和试剂：OCA(厦门海乐景生化有限公司，批号：171201)；RSV(上海迈瑞尔化学技术有限公司，批号：70837024)；高脂模型饲料[百事创新(北京)科技有限公司，批号：19032504HS2.5]；羧甲基纤维素钠(天津市大茂化学试剂厂，批号：20181006)；吐温-20(国药集团化学试剂有限公司，批号：20090327)；CCl4(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180228)；甲醛溶液(国药集团化学试剂有限公司，批号：150422)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180426)；橄榄油[嘉里粮油(天津)有限公司，批号：B20180423X]；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP),美国贝克曼库尔特有限公司全自动生化分析仪配套试剂盒，批号分别为AUZ5326、AUZ5173、AUZ5653；甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA) 试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号分别为20190228、20190301、20190510。实验仪器：JNM-ECA-400超导核磁共振仪(日本电子株式会社)；API-150(ESI)质谱仪(美国ABI公司)；yz-9502医用冷藏冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司)；KZ-Ⅱ匀浆仪(赛维尔生物科技有限公司)；PL-203电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；AU5800全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司)；电恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；D3024R台式高速冷冻型微量离心机[大龙兴创实验仪器(北京)有限公司]；Rt2100c酶标检测仪(美国Rayto)；NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo)；SW-CJ-1FD超净工作台；FBZ2001-up-p标准试剂型纯水仪(青岛富勒姆科技有限公司)。

1.2 动物分组及NAFLD模型的建立 将雄性C57小鼠37只适应性饲喂，饲养期间保持周围环境安静，温度(22±2)℃，相对湿度50%～60%,自由摄食饮水。6 d后随机分为6组，即空白对照组(CON组)、NAFLD模型组(MOD组)、OCA组、RSV组、联合用药低剂量组(OCA+RSV-L组)和联合用药高剂量组(OCA+RSV-H组)，除MOD组7只小鼠外，其余每组6只小鼠。给予CON组小鼠腹腔注射同等体积的质量分数0.9%氯化钠溶液，其余各组小鼠在第1天、第4天、第8天、第12天、第16天、第20天腹腔注射低剂量体积分数0.03% 的CCl4橄榄油混合溶液，每天除CON组小鼠饲喂正常维持饲料外,其余各组小鼠均饲喂高脂饲料造模，各组小鼠自由饮水，每周称1次体质量，连续饲喂4周后，于第28天尾静脉取血，检测小鼠血清TG、TC 水平，初步筛查其是否造模成功。

1.3 给药方法及取材 诱导小鼠形成NAFLD模型后，继续给予适当的高脂饲料，每天 12:00 ，CON组和MOD组灌服0.5%CMC-Na 溶液0.2 mL/次,OCA组、RSV组、 OCA+RSV-L组和OCA+RSV-H组分别以0.04、1.33、(0.04+0.02)和(2.45+1.33)mg/d剂量的0.5%CMC-Na混悬液灌胃(剂量设置依据按OCA和RSV推荐剂量及中毒剂量折算成小鼠与人的等效剂量，并以实验验证)，连续给药4周。每周称1次体质量，在同时连续给脂给药4周后，停脂不停药2 d，禁食(不禁水)12 h至次日8:00，然后摘除小鼠眼球取血，收集血液，3 500 r/min离心10 min，取上清，用于测定血清学指标；将小鼠麻醉后处死，剖取肝脏和脾脏后进行称量，计算肝指数；取肝右叶相同部位组织用4%的甲醛溶液固定后用于病理学检查；同时取肝左叶相同部位的肝组织，加适量无水乙醇制备10%肝组织匀浆液,用于肝脂质指标的检测，于-80 ℃保存备用。

1.4 肝指数和肝脂质测定 取完整肝脏后进行称重,并按下列公式[肝指数=肝湿重(g)/体质量(g)×100%]计算肝指数。准确称取肝组织100 mg，按照重量(mg)∶体积(μL)=1∶9的比例，加入9倍体积的匀浆液(无水乙醇) 900 μL,使用KZ-Ⅱ匀浆仪碾磨2 min后以 2 500 r/min离心10 min，取上清液用酶标检测仪测定TC、TG和FFA,分别按照TC、TG和FFA试剂盒说明书上提供的步骤及方法进行操作。

1.5 小鼠肝功能和血脂生化指标检测 用药4周后采集小鼠血液标本，待血液凝固约0.5 h后，3 500 r/min离心10 min取上清。采用贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪对CON组、MOD组、OCA组、RSV组、OCA+RSV-L组和OCA+RSV-H组小鼠血清进行检测，包括ALT、AST、ALP、TG、TC、LDL-C和HDL-C等肝功能和血脂生化指标。

1.6 肝组织病理学检查 取肝右叶相同部位的肝组织，用4%的甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察小鼠肝脏组织病理学变化。取同一位置肝组织，制备冷冻切片，油红O染色，光学显微镜下400倍视野下观察小鼠肝脏脂质分布情况。挑选每组内每张切片200倍视野下进行拍照，拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件，分别测量区域红色脂滴像素面积及脂滴面积百分率。

2 结果

2.1 OCA和RSV联用对小鼠瘙痒症的影响 在给造模小鼠进行不同药物治疗过程中发现，与CON组比较，MOD组和其他四组小鼠皮肤松弛，毛色暗淡稀疏。与MOD组比较，OCA组有4只小鼠腰背部和(或)面部出现抓挠啃食引起脱毛，瘙痒率66.7%；其余各组小鼠均未出现脱毛现象。

2.2 OCA和RSV联用对小鼠肝指数的影响 与CON组比较，MOD组体质量和肝湿重均减轻(P均<0.05)，而肝指数增加(P均<0.01)。与MOD组比较，OCA组、RSV组和OCA+RSV-L组的肝指数减少(P均<0.05)；而OCA+RSV-H组的肝指数变化不明显(P>0.05)。OCA+RSV-L组较OCA组肝指数减少(P<0.01)；OCA+RSV-H组的体质量和肝湿重较RSV组均有所增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肝湿重和肝指数比较

注：与CON组比较，aP<0.05；与MOD组比较，bP<0.05；与OCA组比较，cP<0.05；与RSV组比较，dP<0.05；与OCA+RSV-L组比较，eP<0.05。

2.3 OCA和RSV联用对小鼠肝脂质的影响 与CON组比较，MOD组小鼠肝内TG和TC水平升高(P均<0.05)。与MOD组比较，RSV组小鼠肝内TC水平降低(P<0.05)；OCA+RSV-H组小鼠肝内TG和TC水平降低(P均<0.01)；OCA+RSV-L组小鼠肝内TG水平降低(P<0.05),而OCA组小鼠肝内TG和TC水平变化均不明显(P均>0.05)，RSV组小鼠肝内TG水平变化不明显(P>0.05),各组小鼠肝内FFA水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)。OCA+RSV-H组较OCA组TC水平降低(P<0.01)；OCA+RSV-L组较RSV组FFA水平升高(P<0.05)，OCA+RSV-H组较RSV组TG水平降低(P<0.01)。见表2。

2.4 OCA和RSV联用对小鼠肝功能及血清生化指标的影响 与CON组比较，MOD组小鼠血清ALT、AST、ALP水平升高(P均<0.01)。与MOD组比较，OCA组、RSV组、OCA+RSV-L组和OCA+RSV-H组小鼠血清ALT、AST和ALP水平均降低(P均<0.01)。OCA+RSV-L组和OCA+RSV-H组较OCA组和RSV组血清肝功能指标呈降低趋势，但差异无统计学意义。OCA+RSV-L组和OCA+RSV-H组比较，OCA+RSV-H组血清ALT水平降低(P<0.05)。见表3。

表2 各组小鼠肝10%匀浆液中TG、TC、FFA水平比较

注：与CON组比较，aP<0.05；与MOD组比较，bP<0.05；与OCA比较，cP<0.05；与RSV比较，dP<0.05；与OCA+RSV-L组比较，eP<0.05。

表3 各组小鼠血清ALT、AST、ALP水平比较

注：与CON组比较，aP<0.05；与MOD组比较，bP<0.05；与OCA+RSV-L组比较，cP<0.05。

2.5 OCA和RSV联用对小鼠血脂生化指标的影响 与CON组比较，MOD组小鼠血清TG、TC、LDL-C水平升高(P均<0.05),血清LDL-C/ HDL-C值增大(P<0.001)。与MOD组比较，OCA组、RSV组和OCA+RSV-L组血清TC水平降低(P均<0.01)，而OCA+RSV-H组血清TC水平降低更显著(P<0.001)，各组小鼠血清TG和LDL-C水平均降低(P<0.001)；OCA组、RSV组、OCA+RSV-L组、OCA+RSV-H组血清LDL-C/ HDL-C值和血清HDL-C水平均增加(P均<0.001)。OCA+RSV-L组较OCA组LDL-C/HDL-C百分数减少(P<0.001)，OCA+RSV-H组较OCA组TG水平降低(P<0.05)；OCA+RSV-H组LDL-C水平和LDL-C/HDL-C值较RSV组均下降(P均<0.01)。见表4。

2.6 OCA和RSV联用对小鼠肝组织形态学的影响 CON组小鼠肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，肝细胞胞质丰富、形态结构正常，肝窦未见明显扩张或挤压，未见明显炎症；MOD组小鼠肝组织中可见大量肝细胞脂肪变性，胞质中可见大小不一的圆形空泡，多见肝细胞水肿，胞质疏松淡染，少量肝细胞水肿至气球样变性，细胞肿胀，核居中，胞质空泡化，多见中央静脉与门静脉周围有少量淋巴细胞与中性粒细胞浸润，并多见脂褐素沉积；OCA和RSV组小鼠的肝脏组织脂肪变性略有改善，但仍可见大量肝细胞脂肪变性，胞质中可见大小不一的圆形空泡；多见中央静脉与门静脉周围有少量淋巴细胞浸润，局部可见较多脂褐素沉积，并伴有巨噬细胞吞噬；而OCA+RSV-L组和OCA+RSV-H组的小鼠肝脏组织病理形态显著改善，但伴有肝细胞水肿和组织中汇管区胆管周围有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润，并可见较多脂褐素沉积，伴有巨噬细胞吞噬。CON组、MOD组、OCA组、RSV组、OCA+RSV-L组、OCA+RSV-H组小鼠肝内脂滴面积百分比分别为(56.71±2.47)%、(68.27±4.61)%、(67.98±12.08)%、(63.71±9.13)%、(23.73±6.97)%、(2.13±0.57)%，与CON组比较，MOD组小鼠肝内脂滴面积百分比增加(P<0.05)。与MOD组比较，OCA+RSV-L组、OCA+RSV-H组小鼠肝内脂滴面积百分比减少(P均<0.05)。OCA+RSV-L组和OCA+RSV-H组较OCA组、RSV组肝内脂滴面积百分比减少(P均<0.05)；OCA+RSV-H组肝内脂滴面积百分比较OCA+RSV-L组减少(P<0.05)。

表4 各组小鼠血脂生化指标水平比较

注：与CON组比较，aP<0.05；与MOD组比较，bP<0.05；与OCA组比较，cP<0.05；与RSV组比较，dP<0.05；与OCA+RSV-L组比较，eP<0.05。

3 讨论

近年来，NAFLD患病率已持续升高约20倍，现已成为一种常见的慢性肝病。有关NAFLD的确切发病机制尚未阐明，目前仍处在假说和争论阶段。“二次打击”学说是解释NAFLD发病机制的传统经典理论，该理论认为，“第一次打击”是胰岛素抵抗(IR)和肝脂质代谢障碍所导致的肝脂肪变性，“第二次打击”则是各种原因导致的氧化应激和脂质过氧化损伤引起肝细胞炎症浸润和肝纤维化。当前，诸多研究数据显示，NAFLD/NASH会对患者的寿命及生活质量产生不良影响，目前NAFLD的治疗主要围绕生活方式改变、身体活动和一般的医疗干预等[17]。然而，患者很难进行长期的生活方式改变和身体活动，而市场上尚无治疗NAFLD和NASH的特效药物。OCA与天然降脂药物RSV联合应用干预NAFLD，可能是一种具有较好前景和效益的方法。RSV调节脂质代谢用于治疗和预防心脑血管疾病[18]，但很少报道其降低胆固醇的潜力。

高甘油三酯血症、高胆固醇血症、高LDL-C水平和低HDL-C水平是肝脂肪变性患者脂代谢平衡中最常见的损伤因素[19]。经过CCl4诱导高脂饮食的NAFLD动物模型是已被广泛用于鉴定其发病机制并评估NAFLD用药疗效的通用做法。在我们的模型中，CCl4诱导高脂饮食的小鼠出现肝脏脂肪变性，脏器脂肪堆积，高脂血症和FFA增加，此近乎模拟了人类NAFLD的全部临床症状表现。本研究结果显示，OCA+RSV-L组、OCA+RSV-H组小鼠的瘙痒比例减少，肝指数显著改善，小鼠肝功能指标ALT、AST、ALP等降低，表明OCA与RSV联用可保肝护肝。此外，我们观察到OCA或RSV单独用药和OCA+RSV联合用药血清TG、TC和LDL-C水平均出现下降，OCA和RSV联用有效干预了CCl4诱导高脂饮食小鼠的NAFLD发展，且与OCA或RSV单独用药相比，OCA和RSV联合给药的效果更显著。而与MOD组相比，OCA+RSV-L组、OCA+RSV-H组小鼠血清中HDL-C水平明显升高。鉴于LDL-C /HDL-C值与冠心病的风险呈正相关[20]，提示OCA或RSV单独用药和OCA+RSV联合用药具有抗动脉粥样硬化的潜力。

本研究结果显示，与MOD组相比，OCA+RSV-L组、OCA+RSV-H组可抑制TG、TC、FFA和LDL-C代谢合成。OCA+RSV-L组、OCA+RSV-H组小鼠肝脏内TG和TC水平均出现显著下降，其疗效优于OCA组或RSV组。同时，组织病理学结果表明，OCA+RSV联用可显著预防CCl4诱导的高脂饮食小鼠肝脏脂质积聚，HE染色和油红O染色观察分析可知，OCA+RSV-L组、OCA+RSV-H组小鼠NAFLD明显改善。该疗效与TG、TC和LDL-C的降低及HDL-C水平升高呈正相关，互相印证。表明CCl4诱导的高脂饮食小鼠通过下调血浆和肝脏中的脂质积累，抑制IR和维持脂代谢平衡，缓解肝脏脂肪变性程度。因此，OCA和RSV联合使用可能是通过影响脂肪动员来改善血脂水平，同时，通过促进肝脏内TC的代谢来减少胆固醇合成，最终达到改善NAFLD的目的。

综上所述，OCA和RSV联用能改善NAFLD小鼠肝功能、降低血脂水平及改善肝组织病理学变化，有效干预CCl4诱导的高脂饮食小鼠NAFLD发展，可作为降低动脉粥样硬化和心脑血管疾病风险的潜在治疗药物，有提高NAFLD治愈疗效的潜力。