三七总皂苷对细胞色素P450酶CYP3A4和CYP2C9的影响*

郭俊刚，高玉平，马维娜

（上海健康医学院附属嘉定区中心医院，上海 201800）

目前，血塞通注射液单用或与西药联用已在临床广泛使用，其中三七总皂苷是血塞通注射液的主要有效成分。三七总皂苷具有消肿止痛、活血散瘀等作用［1-2］，是一种非特异性钙通道阻滞剂，能有效抑制平滑肌收缩，发挥扩张血管、降低动脉血压、降低血黏度、改善血液流变学、抗动脉粥样硬化等作用［2-3］。细胞色素 P450（CYP450）同工酶参与各种外源性物质包括治疗药物和一些内源性物质的代谢，是重要的药物代谢酶类，受遗传、机体、年龄、营养状态、疾病等多种因素的影响，常见亚型如 CYP1A2，CYP2C9，CYP2D6，CYP3A4，参与大约90%的药物代谢［4］。CYP450酶在药物代谢中的作用对临床合理用药及实施个体化给药方案和避免药品不良反应都有重要意义［5］。中药的成分比较复杂，其有效成分或单体在体内同样需要通过CYP450酶系进行代谢，也会对其活性产生抑制或诱导作用，导致联合用药后药物在体内的代谢发生变化［6］。本研究中通过培养Chang Liver细胞，检测三七总皂苷对CYP3A4和CYP2C9 mRNA及蛋白表达的影响，明确其作用机制，为临床合理使用提供依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：WFH-203B型低温高速离心机（美国Beckman CouLter公司）；CI-160-A型恒温 CO2培养箱（美国Thermo公司）；biorad免疫印迹电泳转膜仪（美国Bio RAD公司）；biotek酶标仪（美国 Bio Tek公司），ND2000型超微量分光光度计（美国Nanodrop公司）；凝胶图像分析系统（法国ViLber公司）。

试药：三七总皂苷（上海一飞生物科技有限公司，批号为 F657123，纯度＞98%）；CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司，批号为 KTC011001）；CYP3A4抗体（美国Santa Cruz公司，批号为 AY-11209R）；CYP2C9 抗体（英国 Abcam公司，批号为 hz-20243R）；胰蛋白酶（GIBCO 公司，批号为 RPT0201）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司，批号为 15596026）；RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司，批号为E5310S）；10%胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，FBS，批号为201406）；青-链霉素（MiLLpore 公 司 ，批号为 PS2004HY）；高糖DMEM培养基（美国Gibco公司，批号为11995-065），蛋白定量试剂盒（碧云天生物公司，批号为34090163）；辣根过氧化酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（HRPGAPDH，上海康成生物工程公司，批号为16274R）。

细胞：Chang Liver细胞（上海中科院细胞研究所，编号为 C0222）。

1.2 方法

细胞系及培养：Chang Liver细胞在37℃及5%CO2培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，1% 双抗（青霉素 100 kU ／L，链霉素 100 kU ／L）培养，2～3 d换1次培养基，当细胞密度达70% ～80%时用0.4%胰酶消化，取对数生长期的细胞。

CCK-8法检测细胞增殖抑制率：将Chang Liver细胞制成1×105个／mL的单细胞悬液，每孔180 μL加入96孔培养板中，置37℃及5%CO2的细胞培养箱中培养。实验组分别加入6个不同浓度的三七总皂苷96孔板内，每孔加药量 20 μL，药物终质量浓度为 6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00 μg ／mL；对照组加等量DMEM培养基，每种剂量设置5个平行孔。在CO2培养箱中培养24 h，吸去上清液，用磷酸缓冲溶液（PBS）漂洗 2 次，再加入 200 μL 培养基，每孔加入CCK-8 溶液 20 μL，继续培养 2 h，取上清液 50 μL，于自动酶标读数仪（490 nm）测定各孔吸光度（A），计算抑制率。抑制率（IR）＝［（A对照组-A实验组）／A对照组］×100%。

RT-PCR法检测相关mRNA表达：采用RT-PCR方法检测三七总皂苷对Chang Liver细胞中CYP3A4和CYP2C9基因表达的影响。Chang Liver细胞接种于6孔板中，接种细胞密度为1×105个／mL，在 37℃及5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞单层贴壁生长至70%左右时，根据药物CCK-8的结果，加入100 μg／mL三七总皂苷分别干预 4，8，24，48 h。培养结束后，从细胞培养板上吸走培养液，加1 mL PBS清洗1次，加入1 mL TRIzol，将细胞从培养板上刮下来吹打，混匀，转移至干净的 1.5 mLEP 管中，加入 200 μL氯仿，摇晃，混匀，使体系成粉红色乳浊状，以12 000 r／min的转速离心15 min，移取上清液至新的1.5 mL EP管中，加入600 μL异丙醇，充分混匀，-20℃助沉45 min后，以12 000 r／min的转速离心15 min；弃上清液，加入1 mL冰 75%RNA专用乙醇，轻弹管底使沉淀悬浮，以 12 000 r／min的转速离心10 min，室温下静置10～15 min，使RNA适度干燥，用不含Rnase去离子水溶解，取2 μL测定浓度。采用逆转录试剂盒，先将RNA反转录为cDNA，再以cDNA作为RT-PCR的反应模板，之后配制反应液进行RT-PCR反应。目的基因CYP3A4和CYP2C9扩增程序如下：95 ℃预变性 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，循环40次，测定融解曲线，最后通过ct值计算mRNA相对表达量。

蛋白质印迹（Western Blot）法检测蛋白表达：取处于对数生长期的Chang Liver细胞接种于24孔板中，置5%CO2、37 ℃培养箱中培养 24 h，加入 100 μg ／mL 三七总皂苷，分别干预 4，8，24，48 h，24 孔板长满细胞后，吸去培养基，加 1 mL冰预冷 PBS（pH ＝7.4）洗 1次，吸去PBS，加入细胞裂解液（RIPA 强裂解液）450 μL，加入蛋白酶抑制剂，低温环境下均匀摇晃30 min使细胞充分裂解。待细胞充分裂解后，将所有细胞加入裂解液中，转移至5 mL试管中超声处理4 s，向1.5 mL进口离心管中加入1／4体积的5X Loading buffer，金属浴100℃煮10 min。室温冷却至4℃，保存样品。配制3.9% 浓缩胶、10% 分离胶。浓缩胶用80 V电压电泳约70 min，之后转膜120 min，TBST缓冲液封闭1 h。继续加入一抗［GAPDH（1 ∶1000），CYP2C9（1∶1000），CYP3A4（1∶200）］，4℃摇床孵育过夜。过夜后的TBST缓冲液洗膜3次，加入稀释2 000倍的二抗，室温放置1 h，TBST缓冲液洗膜后化学发光试剂显色发光。

1.3 统计学处理

采用SAS 9.3统计软件处理。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间平均值比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对细胞株的抑制作用结果见图 1。不同质量浓度三七总皂苷（6.25，

12.50，2 5.00，50.00，100.00，200.00 μg ／mL）对 Chang Liver细胞均有不同程度的抑制作用，抑制率大小呈浓度依赖性。Western Blot法及RT-PCR试验中所选取三七总皂苷的浓度为 100 μg／mL。

图1 三七总皂苷对Chang Liver细胞的抑制作用

2.2 对CYP3A4和CYP2C9蛋白表达的影响

结果见表1、图2至图4。可见，三七总皂苷对Chang Liver细胞是一种诱导作用。各组CYP2C9的蛋白表达量与空白对照组相比，差异均有显著性（P＜0.05），且随着作用时间的延长，各组诱导水平也相应增加。8 h组、24 h组、48 h组CYP3C4蛋白表达量与空白对照组相比，差异均有显著性（P＜0.05），但4 h组与空白对照组相比无显著差异（P＞0.05），各组相对蛋白表达量同样呈时间依赖性。

表1 三七总皂苷对CYP3A4和CYP2C9蛋白及mRNA表达的影响（相对表达量，±s）

表1 三七总皂苷对CYP3A4和CYP2C9蛋白及mRNA表达的影响（相对表达量，±s）

蛋白表达 mRNA组别空白对照组干预 4 h组8 h组24 h组48 h组CYP3A4 0.19 ±0.02 0.34 ±0.03 0.53 ±0.06 0.67 ±0.07 0.86 ±0.08 CYP2C9 0.18 ± 0.03 0.68 ± 0.06 0.93 ± 0.08 1.03 ± 0.12 1.11 ± 0.09 CYP3A4 0.63 ± 0.07 0.95 ± 0.09 1.21 ± 0.06 1.33 ± 0.07 1.64 ± 0.09 CYP2C9 0.59 ±0.06 0.92 ±0.09 1.19 ±0.08 1.27 ±0.12 1.84 ±0.14

图2 三七总皂苷对Chang Liver细胞中CYP2C9及CYP3A4蛋白表达的影响

图3 不同时间三七总皂苷对CYP2C9蛋白的影响

图4 不同时间三七总皂苷对CYP3A4蛋白的影响

2.3 对CYP3A4和CYP2C9 mRNA表达的影响

结果见表1、图5至图7。结果显示，三七总皂苷对Chang Liver细胞是一种诱导作用。4 h组的 CYP2C9 mRNA表达量与空白对照组相比无显著差异（P＞0.05），8 h组、24 h组、48 h组的mRNA表达量与空白对照组相比均有显著差异（P＜0.05），且随着作用时间的延长，各组的诱导水平也相应增加。4 h组的CYP3A4 mRNA表达量与空白对照组相比无显著差异（P＞0.05），8 h组、24 h组、48 h组的mRNA表达量与空白对照组相比均有显著差异（P＜0.05），且随着作用时间的延长，诱导水平也相应增加。

图5 三七总皂苷对Chang Liver细胞中CYP2C9及CYP3A4 mRNA表达的影响

3 讨论

三七是一种多年生草本植物，三七总皂苷中三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、Rb1、Rd和 Re为其主要成分，约占总皂苷含量的80%［7］。三七中皂苷在抗缺氧、抗衰老，及提高人体免疫力方面都具有明显优势，临床常用于心脑系统、血液系统、免疫系统、神经系统及物质代谢等方面疾病的治疗［8-9］。三七总皂苷对P450酶的表达有一定影响，可进一步影响其他药物在体内的代谢。CYP450酶中最重要的一个亚型是CYP3A4，临床约60%的常用药物由CYP3A4代谢［10］，其主要在肝脏和小肠中表达，并参与免疫抑制剂、降血糖药、抗生素、抗肿瘤药物等多种药物的代谢［11］。陈艳进等［12］研究表明，三七总皂苷对CYP3A4酶的活性水平无明显作用，但对mRNA表达水平有明显的诱导作用（P＜0.05），这可能是在转录过程中出现了抑制，导致酶活性水平无明显作用。CYP1A占整个细胞色素P450酶系的13% ～15%，参与了约5%上市药物的代谢，主要分布于肝脏中，另外在肠道、脑、肺等组织中也有少量分布，主要参与多环芳烃和芳香胺类化合物的代谢［13］。LIU 等［14］的研究阐明了三七总皂苷对大鼠CYP1A2的诱导作用，通过Western Blot法证实了使用三七总皂苷后肝脏中CYP1A2蛋白表达上调。通过研究CYP1A2的专属探针药物咖啡因、氨苯砜的体外代谢变化，并评价血塞通对CYP1A2的作用［15］，发现血塞通组探针药物咖啡因体外半衰期为（9.24±2.37）min，明显短于对照组的（25.15 ±2.02）min（P＜ 0.05），说明血塞通对CYP1A2有诱导作用。

图6 不同时间三七总皂苷对CYP2C9 mRNA的影响

图7 不同时间三七总皂苷对CYP3A4 mRNA的影响

本研究中选取目前用于药物研究中与原代培养肝细胞特性最接近的Chang Liver细胞作为实验细胞株，结果表明，100 μg／mL三七总皂苷干预 Chang Liver细胞 4，8，24，48 h 后，CYP3A4 和 CYP2C9 蛋白表达及mRNA表达与空白对照组相比均有不同程度的升高，且呈时间依赖性，提示三七总皂苷对CYP3A4和CYP2C9是一种诱导作用。前期研究中以三七总皂苷为主要成分的血塞通与氯沙坦钾联合使用后大鼠体内氯沙坦钾及其活性代谢产物EXP3174的血药浓度，结果显示，联合用药后氯沙坦钾的半衰期缩短和表观分布容积显著降低（P＜ 0.05），达峰时间显著延长（P＜ 0.05），代谢物EXP3174的半衰期显著缩短（P＜0.05），达峰时间显著延长（P＜0.05）。半衰期缩短，说明氯沙坦钾与血塞通联用后，缩短了药物在体内发挥药效的时间，诱导其代谢；达峰时间缩短，说明原型产物在体内减少，血塞通对氯沙坦钾起到了一定的诱导作用［16］。与本研究结果一致，即三七总皂苷能诱导CYP2C9及CYP3A4酶的活性，并加快氯沙坦钾在体内的代谢，因此2种药物在联用时可能需要调整给药间隔及给药次数。WANG等［17］同样考察过丹参片和氯沙坦钾在SD大鼠体内联合用药后，氯沙坦钾和活性代谢产物EXP3174的药代动力学变化及丹参片的活性成分对CYP450酶的影响，结果表明，丹参片中的丹酚酸B及丹参酮ⅡA可能是通过诱导CYP3A4和CYP2C9酶的活性而加快原型药物氯沙坦钾在大鼠体内的代谢，提示丹参片和氯沙坦钾联用后可能会产生相互作用。

综上所述，三七总皂苷作为临床常见药物血塞通及血栓通的活性成分，具有多种药理活性，在我国可能通过影响CYP450酶的活性而与其他药物发生相互作用，临床需要更加关注用药剂量的调整及不良反应。