苗药黑骨藤配伍金铁锁的总皂苷含量测定

陈秋霞　李江　杨轶

【摘 要】 目的：建立黑骨藤配伍金铁锁的总皂苷含量测定方法。方法：以齐墩果酸为对照，用5%的香草醛-冰醋酸及高氯酸进行显色，在550nm波长下运用紫外-分光光度法对总皂苷含量进行测定。结果：齐墩果酸在0.002～0.012mg/mL浓度范围与吸光度呈良好的线性关系，回归方程A=62.4C-0.0101，r=0.9991，回收率为96.19%，RSD为1.43%。结论：建立了黑骨藤配伍金铁锁回流提取法中总皂苷含量测定方法，该方法快速、简便，精密度和稳定性良好，可用于黑骨藤配伍金铁锁复方制剂的质量控制。

【关键词】 黑骨藤；金铁锁； 配伍；总皂苷； 紫外-可见分光光度法

【中图分类号】R29 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2017）03-0030-03

黑骨藤与金铁锁均为贵州十大苗药，两药均可用于风湿疼痛[1]。黑骨藤为萝摩科杠柳属植物黑龙骨Periploca forrestii Schltr的干燥根或全株，有通经、活血、解毒，祛风的功效，用于风湿关节炎痛、跌打损伤等[2]；金铁锁为石竹科金铁锁属植物金铁Psammosilene tunicoides W.[KG-*3/5]C.[KG-*3/5]Wu et C.[KG-*3/5]Y.[KG-*3/5]Wu的干燥根，具有祛风除湿，散瘀止痛，解毒消肿，用于风湿痹痛，胃脘冷痛，跌打损伤，外伤出血等[3]。本实验研究的复方是国家名老中医邱德文教授用于类风湿关节炎的临床经验方，两药配伍疗效确切。本方是由黑骨藤与金铁锁组成，处方用量比例黑骨藤∶[KG-*3/5]金铁锁为6∶[KG-*3/5]1，金铁锁为国家2级保护稀有植物。本课题组在前期对于两药配伍的不同极性提取物的镇痛、抗炎作用进行研究，发现在相同剂量下，70%乙醇提取物的镇痛抗炎作用显著优于水提取物的镇痛抗炎作用[4]，且进一步实验研究发现两药配伍后的总皂苷具有抗类风湿关节炎的作用（待发表），故对两药配伍的70%乙醇提取物中总皂苷的含量进行研究，以期为建立两者组成的复方的质量标准提供相关理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 紫外分光光度计GBC Cintra 20（澳大利亚照生公司）；RE-2000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；BT 125D 型分析天平（Sartorius，德國赛多利斯）；恒温水浴锅（江苏国胜实验仪器厂）。

1.2 材料 黑骨藤采于贵州乌当区，经贵阳中医学院刘芃教授鉴定为萝摩科杠柳属植物西南杠柳Periploca forrestii Schltr的根；金铁锁采于贵州威宁县，经贵阳中医学院刘芃教授鉴定为石竹科金铁锁属植物金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et c.Y.Wu的根；齐墩果酸（批号：110709-200304，中国药品生物制品检定所提供）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 精密称定配伍药材（黑骨藤∶[KG-*3/5]金铁锁=6∶[KG-*3/5]1）粉末（过60目筛）2.0g，加50倍量的70%乙醇，80℃水浴中冷凝回流提取3次，每次2h，滤过，合并滤液。将滤液减压浓缩至干，用25mL水分散（混悬液），依次用石油醚、正丁醇分别萃取3次，每次25mL，弃去石油醚萃取液，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂，用甲醇定容至10mL容量瓶中，作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸（不溶于水，在甲醇中溶解性好）对照品适量，加甲醇溶解配制成质量浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。

2.3 含量测定方法及测定波长的选择[5] 精密吸取0.2mL对照品溶液和供试品溶液于10mL具塞试管中，水浴挥干甲醇，分别加入5% 香草醛-冰醋酸溶液（鲜配鲜用）0.2mL和高氯酸溶液0.8mL，于60℃水浴中显色15min，取出后立即用冰水冷却5min，再加冰醋酸至10mL，摇匀，静置10min，以甲醇同法制备空白参比。在200～700nm 范围进行扫描，两者均在550nm处有最大吸收。见图1、2。

2.4 标准曲线制备 分别精密吸取对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于10mL具塞试管中，按“2.3 ”项下自“水浴挥干甲醇”起依法操作，在550nm处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标、质量浓度（C）为横坐标进行线性回归。见图3。

结果表明，齐墩果酸在0.002～0.012mg/mL浓度范围与吸光度成呈良好的线性关系，回归方程：A =62.4C-0.0101，r=0.9991。

2.5 稳定性试验 精密吸取0.2mL供试品溶液，按“2.3” 项下自“水浴挥干甲醇”起依法操作，在90min内每隔10min时，在 550nm处测定一次吸光度。供试品溶液吸光度RSD为1.12%，表明供试品溶液显色后，在90min内基本稳定。

2.6 精密度试验 精密吸取0.2mL对照品溶液，共6份，按“2.3” 项下自“水浴挥干甲醇”起依法操作，在90min内，550nm处测定吸光度。结果表明，对照品吸光度RSD为1.11%，表明该方法的精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批次配伍药材各6份，按“2.1”项下方法操作制备供试品溶液，按“2.3” 项下自“水浴挥干甲醇”起依法操作，在550nm处测定吸光度，结果总皂苷含量RSD为1.27%。

2.8 加样回收试验 精密称取“2.7”项下已知含量的同一批次配伍药材1.0g，共6份，分别加入等量齐墩果酸对照品适量，按“2.1”项下和“2.3” 项下方法操作，在550nm处测定吸光度，并计算回收率。

2.9 供试品提取条件的正交试验 根据可能影响总皂苷醇提取的因素，以乙醇用量（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、提取次数（D）作为考察因素，每个因素取3个水平，提取液减压浓缩至干，用25mL水分散（混悬液），依次用石油醚、正丁醇分别萃取3次，每次25mL，弃去石油醚萃取液，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂，用甲醇定容至10mL容量瓶中，作为正交试验样品，以总皂苷含量为主要考察指标。采用L9（34）正交设计，对配伍药材提取工艺进行优化。因素水平表、试验安排表、方差分析表见2～4。

方差分析表明，各因素对处方中总皂苷的含量提取均无显著性影响。极差分析，表明四个因素对处方中总皂苷含量的提取影响因素大小顺序为A>B>D>C，优选工艺为A2B3C3D3，，即药材用50倍量70%乙醇，80℃回流提取3次，每次2h。

2.10 样品含量的测定 精密称定药材粉末2.0g，按正交试验结果制备供试品溶液，按“2.3 ”项下自“水浴挥干甲醇”起依法操作，在550nm处测定吸光度，以齐墩果酸计，计算样品中总皂苷的含量。见表5。

3 讨论

实验采用正交设计试验对供试品回流提取条件进行考察，采用紫外-可见分光光度计法，以齐墩果酸为对照品，香草醛-高氯酸法显色，对配伍中药材中的总皂苷的含量测定进行了方法学考察。本法操作简单、准确性高、重复性好，可为黑骨藤配伍金铁锁复方的质量控制研究提供了有效手段。为减少误差， 称样、 加入显色剂等操作均应由专人操作，所用的香草醛-冰醋酸溶液应现配现用，否则空白值的顏色会加深，影响测定的结果。

文献报道采用熊果酸、齐墩果酸分别用于黑骨藤、金铁锁的含量测定[6-7]。熊果酸与齐墩果酸果酸均属于五环三萜类成分，分别为乌苏烷型、齐墩果烷型，两种类型在分子结构上甲基位置不同，但其母核均为五环型[8]。在测定波长的选择过程中，分别对熊果酸、齐墩果酸进行波长扫描（200～700nm），结果均在550nm处由最大吸收，结合实验成本，选用齐墩果酸作为对照品。

参考文献

[1]邱德文，杜江.贵州十大苗药[M].北京：中国古籍出版社，2008.

[2]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准 [M].贵州：贵州科技出社，2003：381.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：220-221.

[4]王文春，李江，童宏龙.苗药黑骨藤配伍金铁锁不同提取物镇痛抗炎作用研究[J].时珍国医国药，2014，25（12）：2821-2823.

[5]刘亮，杜江，潘炉台，等.苗药观音草中总皂苷的含量测定[J].中国民族民间医药，2011（4）：2-3.

[6]申海艳，龚小见，李文敏，等.苗药黑骨藤中总皂苷含量的测定[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：94-97.

[7]王龚，周欣.金铁锁总皂苷含量测定[J].贵州师范大学学报，2012，5（6）：4-6.

[8]匡海学.中药化学[M].北京：中国中医药出版社，2003：221-222.

（收稿日期：2016-11-22 编辑：穆丽华）