正交试验法优选益阴消渴滴丸提取工艺*

宋国红，李 卿，尹小玲

（1.重庆市中药研究院，重庆 400065； 2.重庆三峡中心医院，重庆 404000）

益阴消渴原剂型为胶囊剂，功能主治为益气养阴、清热生津，用于气阴不足所致消渴及2型糖尿病见上述证候者。由于原制剂中有效成分葛根素在水中溶解度较差，口服后吸收缓慢，选用的普通胶囊制剂采用部分药物粉碎后直接入药的方式，影响其临床疗效的发挥和患者的顺应性。本研究中采用先进提取纯化技术，提取分离益阴消渴处方中有效成分，提高有效成分含量，采用固体分散技术研制成现代速释制剂，既能降低血糖，又能改善糖尿病症状，减少糖尿病并发症，保护糖尿病受损靶器官，剂型先进，释药速度快，生物利用度高。本研究中采用L9（34）正交试验设计，以处方中君药葛根的主要成分葛根素为测评指标，优化益阴消渴方的提取工艺，为其工业化生产提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：LC-2010A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SB-5200D型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HH-S型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；AE240型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

试药：葛根、野苦瓜、荔枝核、山药药材均购自重庆市菜园坝中药材市场，经重庆市中药研究院肖铭玉副研究员分别鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）ohwi的干燥根，葫芦科植物野苦瓜Momordica charantiaL.的成熟果，无患子科植物荔枝Litchi chinensisSonn.的干燥成熟种子，薯蓣科植物薯蓣Dioscorea oppositeThunb.的干燥根茎；葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号为752-200108）；甲醇为色谱纯，水为一级水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 葛根素含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验［1］

色谱柱：Diamonsil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -水（28 ∶72）；流速：1 mL ／min；柱温：30 ℃；检测波长：250 nm。在此条件下的色谱图见图1。葛根素色谱峰与相邻峰分离度良好。

2.1.2 溶液制备

取葛根素对照品18.64 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。照样品处方比例，取野苦瓜2.5 g，葛根15.5 g，荔枝核1.0 g，山药1.0 g，共9份，按正交试验方案回流提取，滤过，浓缩至适量，用乙醇定容至250 mL，摇匀；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声提取（功率为200 W，频率为50 kHz）15 min，冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，取续滤液，即得供试品溶液。照样品处方比例，称取缺葛根的其余3味药材，照供试品溶液制备方法制备缺葛根阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取葛根素对照品贮备溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10 μL，进样，按拟订色谱条件测定，以葛根素进样量（X，g）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y＝7131295X-34632，r＝0.9999（n＝5）。结果表明，葛根素进样量在 0.3728 ～3.728 0 g范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液10 μL，在拟订色谱条件下连续进样6次，测定。结果的RSD为0.78%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，1，4，8，16 h时进样测定，结果峰面积值的RSD为0.94%（n＝6），表明供试品溶液在16 h内较稳定。

重复性试验：取制备的同一样品6份，照2.1.2项下供试品溶液制备方法中“精密量取2.0 mL”起，制备供试品溶液，按拟订色谱条件，测定峰面积，计算含量。结果的RSD为1.06%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一样品6份，精密加入葛根素对照品适量，照2.1.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 葛根素加样回收试验结果（n＝6）

2.2 提取试验单因素考察

以乙醇为提取溶剂，采用回流法进行提取，以葛根素的含量为考察指标，设置单因素试验分别考察料液比、提取时间和提取次数对葛根素的影响。

料液比：按处方比例，称取5份样品，分别加入4，6，8，10，12 倍量 65% 乙醇，提取 2 次，每次 60 min，滤过，合并滤液，加乙醇定容至 250 ml，摇匀。照 2.1.2 项下供试品溶液制备方法中“精密量取2.0 mL”起，制备供试品溶液，进样测定。

提取时间：按处方比例，称取5份样品，分别加入10倍量 65% 乙醇，提取 2 次，时间为 30，40，60，70，80 min，滤过，合并滤液，加乙醇定容至250 mL，摇匀。照2.1.2项下供试品溶液制备“精密量取2.0 mL”起，制备供试品溶液，进样测定。

提取次数：称取5份样品，加入10倍量65%乙醇，分别提取 1，2，3，4 次，时间为 60 min，滤过，滤液加乙醇定容至250 mL，摇匀。照2.1.2项下供试品溶液制备“精密量取2.0 mL”起，制备供试品溶液，进样测定。

试验结果：随着料液比的增加，葛根素含量增加，在8倍量时达最大值，再增大提取溶剂用量，含量不再增加。因此提取溶剂的用量以6，8，10倍量作为正交试验料液比的3个水平；回流提取时间试验结果表明，试验前段随着提取时间的增加，葛根素含量增加，60 min后葛根素含量趋于稳定，故选择回流50，60，90 min作为正交试验提取时间的3个水平；提取次数试验结果表明，葛根素含量在提取2次后维持在相对平稳状态，故选择1，2，3次作为正交试验提取次数的3个水平。

2.3 提取工艺优化

正交试验：以提取液中的葛根素为考察指标，因素A为乙醇浓度，因素B为溶剂用量，因素C为提取时间，因素D为提取次数，采用L9（34）正交试验进行试验。结果见表2和表3。可见，影响提取效果的因素顺序为D＞A＞C＞B，以D3A3C3B2组合最佳。因素A与因素D影响较大，因素C与因素B影响较小，故从节能、低成本考虑，生产中采用70%乙醇提取3次，乙醇用量为药材量的6倍，第1次回流1.5h，第2，3次回流1 h。

2.4 验证试验

为验证优选工艺的合理性，根据拟订提取方法，称取野苦瓜20 g，葛根124 g，荔枝核8 g，山药8 g，共3份，采用70%乙醇提取3次，乙醇用量为药材量的6倍，第1次回流1.5 h，第2次、第3次回流1 h，滤过，合并滤液，回收乙醇，并用乙醇定容至适量，测得葛根素含量分别为 0.846%，0.851%，0.848%，RSD为 0.30% （n＝3）。表明益阴消渴滴丸新的提取工艺能达到提取要求，符合实际生产需要，提取工艺条件稳定可行。

表2 正交试验因素水平及结果（n＝9）

表3 方差分析

3 讨论

本试验中通过影响提取效率的单因素考察与正交试验相结合的方式，优化了益阴消渴方的初步提取工艺，为后续分离纯化提供了数据分析基础。筛选优化工艺参数时，不仅考虑了葛根素的提取率，且充分注重提取方法在工业化大生产中的实际应用，即生产成本，人力、物力消耗，溶剂损耗，提取周期的设置等，节省各项生产中消耗支出，极大地增强了企业的产品竞争力。

参考文献［2-10］，葛根含多种化学成分，包括黄酮类、三萜类、甾体类、香豆素类，其提取方法有乙醇回流提取法、乙醇超声提取法、微波法、超临界提取法、水煎煮提取法等；野苦瓜主要化学成分包括三萜、甾类、生物碱；荔枝核含皂苷；山药含游离氨基酸，尿囊素，胆碱，麦角甾醇等，以上各药所含主要有效成分在水和乙醇中均能较好地溶解。前期预试中，对处方中药材的提取方法进行了初步筛选，结果发现，以葛根素为代表的检测指标采用水煎煮法进行制备，其含量为0.65%；采用乙醇回流法进行提取，葛根素含量为0.82%。2种提取方法差异明显，故本研究选用乙醇回流法进行制备工艺优化。

采用正交试验优化中药类产品提取工艺时，多采用含量检测结合浸膏收率的多指标试验优选工艺参数，由于浸膏收率不但不能突出表明该工艺的优越性，各项影响因素及水平对浸膏收率的影响不尽相同，反而可能阻碍其含量检测指标对试验结果的分析和判断。而本试验中制备高效富集处方的有效部位群要为下一步纯化提供数据基础，故未选择浸膏收率作为该优化提取工艺参数的指标。益阴消渴原制剂为部分葛根药材粉碎入药，葛根中主要成分葛根素溶出较慢［11-14］，在人体内吸收和利用较差。本试验中选用乙醇回流提取法进行制备，野苦瓜、葛根等有效成分相当部分都能从药材中提取，再经大孔树脂富集、纯化，中间固形物收率减少，日服用量降低，利用固体分散技术制成滴丸剂，药物中有效成分溶出速度加快，生物利用度提高。