超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法分析茶叶中联苯肼酯残留与风险评估

钟 青，罗逢健，陈宗懋，崔 璇，周 利，张新忠

(1.中国农业科学院茶叶研究所农产品质量安全研究中心，浙江 杭州 310008；2.天津农学院园艺园林学院，天津 300384)

联苯肼酯(bifenazate，C17H20N2O3，CAS No.：149877-41-8)是一种由美国科聚亚公司研发，2008年在我国获得部分登记的联苯肼类杀螨剂，其化学结构式示于图1。它可作用于螨类线粒体细胞色素b(cytb)和电子传递链cytb复合物Ⅲ的Q0位点，杀卵活性及击倒优势良好，目前与其他杀螨剂无交互抗性，对螨类各个生长阶段皆有效，且持效期长[1-2]。

图1 联苯肼酯的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of bifenazate

联苯肼酯主要登记用于防治草莓[3]、柑橘[4]、桑树[5]和苹果[6]等水果，蔬菜和其他经济作物上的害螨。近年来，研究结果表明，联苯肼酯在茶树上用于防治茶橙瘿螨、茶叶瘿螨、茶红蜘蛛等螨类害虫，效果很好[7-8]，可替代现有茶园里施用的常规药剂。田间施用联苯肼酯后，会造成农产品及环境中的残留，我国规定啤酒花和薄荷中的联苯肼酯最大残留限量(MRL)值为20、40 mg/kg；规定棉籽、蔬菜、水果、坚果等的联苯肼酯MRL值为0.2～7 mg/kg；欧盟、日本和韩国分别规定茶叶中联苯肼酯MRL值为0.02、2、3 mg/kg[9]。然而，目前我国和食品法典委员会CAC暂无茶叶中联苯肼酯MRL值的有关规定。

目前，研究人员多采用液相色谱-紫外检测法或液相色谱-串联质谱法分析联苯肼酯在不同样品基质中的残留。如Park等[10]建立了液相色谱法分析谷子、芸豆、柑橘、紫苏叶和蘑菇等多种基质中的联苯肼酯残留，结果表明，在0.1～0.5 mg/kg添加水平下该方法的回收率为73.1%～104.3%，RSD为0.2%～9.7%，定量限为0.01 mg/kg；张月等[11]采用UPLC-MS/MS法检测木瓜上联苯肼酯及其代谢物的残留量；张娇娇等[2]和欧阳文森等[12]研究了联苯肼酯在柑橘上的消解动态；何建红等[3]采用UPLC-MS/MS法研究了联苯肼酯在草莓上的残留降解动态；Satheshkuma等[13]采用HPLC-DAD法研究了热带气候环境条件下红茶样品中联苯肼酯消解动态，半衰期为1.03～1.36天，建议安全采收期PHI为16天，方法最低添加浓度为0.10 mg/kg，远高于欧盟规定的茶叶中联苯肼酯MRL值0.02 mg/kg；另有报道采用液相色谱-紫外检测法进行联苯肼酯原药[14]和制剂分析[15]， 以及柑橘[16]和土壤[16]中联苯肼酯的残留分析。尚未见联苯肼酯在茶园施用后，其残留降解情况的相关报道。

为了评价联苯肼酯在茶叶上的消解趋势和残留水平，明确其在茶叶生长过程中的降解规律，为联苯肼酯在茶叶上的安全和合理用药、茶叶应用安全性评价提供科学依据。本研究拟采用QuEChERS法净化茶叶，超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测茶叶鲜叶和成茶中联苯肼酯残留量，利用该方法研究我国气候条件下43%联苯肼酯悬浮剂在湖南永定、福建松溪和浙江绍兴三地茶园的残留消解动态和最终残留实验，并进行相关风险评估。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

UPLC/Quattra Premier XE超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪：美国Waters公司产品，配有电喷雾电离源(ESI)，MassLynx 4.1质谱工作站；高速离心机：德国Sigma公司产品；电子分析天平(0.000 1 g 和0.01 g)：美国Mettler公司产品；R-210 BUCHI旋转蒸发仪：瑞士BUCHI Labortechnik A G公司产品；DFT-200食品粉碎机：温岭市林大机械有限公司产品；KQ-250DB超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；T18均质器：德国IKA公司产品；Vortex-2涡旋混合器：美国Scientific公司产品。

乙腈、无水硫酸镁、氯化钠：均为分析纯，上海试四赫维化工有限公司产品；N-丙基乙二胺(PSA)填料(40～60 μm)，石墨化炭黑(GCB)填料(100～150目)：天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；纯净水：杭州娃哈哈公司产品；联苯肼酯标准品(纯度98%)：德国Dr.Ehrenstorfer公司产品。

1.2 残留实验

1.2.1茶鲜叶中消解动态实验 选择浙江绍兴、福建松溪和湖南永定三地长势均匀的茶园，在2013年和2014年的7～8月茶叶生长季节，以43%联苯肼酯悬浮剂制剂以45 mL/亩(有效成分290.25 g/公顷)剂量，每亩兑水60 L，采用背负式喷雾器来回均匀叶面喷雾1次，施药后间隔2 h(原始沉积量)、1、2、3、5、7、10、14、21、28天，采用随机法15点采集1 kg茶叶鲜叶，混匀后，四分法取样，用食品粉碎机磨碎，-18 ℃存放备用，分别测定鲜叶上联苯肼酯残留量，获得对应的消解动态曲线和半衰期。设3个重复实验，每重复小区面积为20 m2。采集施药前的茶叶鲜叶样品作为空白对照。

1.2.2最终残留实验 在1.2.1节的相同地点和相同时间，按照制剂30 mL/亩(有效成分193.5 g/公顷，推荐剂量)和制剂45 mL/亩(有效成分290.25 g/公顷)两个剂量浓度，每亩兑水60 L，药液质量浓度分别为215 mg/L和322.5 mg/L，采用手动背负式喷雾器施药1～2次，施药间隔7天，距最后一次施药后5、7、10、14天，分别以随机法15点采摘1 kg茶叶鲜叶一芽二叶、三叶，将鲜叶按照当地常规工艺方法加工制成成茶(浙江炒青绿茶、湖南烘青绿茶、福建红茶)，用食品粉碎机粉碎后，-18 ℃存放备用，分别测定成茶茶叶中联苯肼酯残留量。每个样品设3个重复实验，每个重复小区面积为20 m2，并设空白对照。

1.3 实验方法

1.3.1提取净化 分别称取磨碎后的样品(5.00 g鲜叶，2.00 g干茶茶粉)，置于50 mL塑料离心管中，加入10 mL水涡旋混匀，30 min后，加入10 mL乙腈(其中，向鲜叶样品加入20 mL乙腈)涡旋混匀，浸泡过夜；加入3 g NaCl混匀均质1 min，超声10 min，以7 500 r/min离心5min；取1.50 mL上层(乙腈层)至装有100 mg PSA+50 mg GCB+200 mg MgSO4净化填料(鲜叶为100 mg PSA+25 mg GCB+200 mg MgSO4)的2 mL离心管中，涡旋混匀，以7 500 r/min离心5 min后，过0.22 μm滤膜至进样瓶，向UPLC-MS/MS进样5 μL，基质外标法测定。

1.3.2色谱条件 Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；柱温40 ℃；进样量5 μL；样品盘温度8 ℃；流速0.25 mL/min；流动相：A为0.1%甲酸乙腈，B为10 mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱程序：0～1.5 min(20%～30%A)，1.5～3.0 min(30%～55%A)，3.0～7.0 min(55%～90%A)，7.0～8.0 min(90%～98%A)，8.0～9.5 min(98%A)，9.5～9.8 min(98%～70%A)，9.8～10.6 min(70%～20%A)，保持1.4 min。联苯肼酯的保留时间为5.8 min。

1.3.3质谱条件 电喷雾电离正离子多反应监测模式(ESI+-MRM)；电喷雾毛细管电压3.0 kV；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；锥孔反吹气(N2)流速50 L/h；脱溶剂气(N2)流速600 L/h；碰撞气(Ar)流速0.25 mL/min；电子倍增器倍增电压650 V；二级质谱母离子驻留时间 0.040 s；锥孔电压 15 V；定量离子对：母离子m/z301.2，子离子m/z198.1，碰撞裂解电压10 eV；定性离子对：母离子m/z301.2，子离子m/z170.1，碰撞裂解电压20 eV。

1.4 标准溶液配制与标准曲线

称取0.010 g联苯肼酯标准品于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配制成200 mg/L标准储备液，-18 ℃保存。将联苯肼酯标准储备液用乙腈-水溶液(5∶5,V/V)稀释成1.00、0.50、0.250、0.10、0.050、0.0250、0.010、0.005、0.002 5 mg/L系列标准工作溶液，UPLC-MS/MS进样5 μL，每个浓度测定3次，以浓度为横坐标(x)，峰面积平均值为纵坐标(y)，获得联苯肼酯标准曲线和线性相关系数。

1.5 添加回收率与精密度

称取经测定不含联苯肼酯的茶鲜叶、绿茶和红茶空白样品，分别添加相当于0.020、0.20、2.0 mg/kg添加水平的标准溶液，涡旋混匀后放置2 h，以更接近于实际样品农药残留情况，然后按照1.3.1节方法加入水和乙腈进行提取净化测定，每个浓度重复6次；同时将处理后得到的空白茶鲜叶(绿茶、红茶)样品溶液，加入相应浓度的标准溶液后定容，配制成基质标准溶液进行测定，计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检测限和定量限。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

分析联苯肼酯残留时，张月等[11]采用乙腈和0.25%乙酸溶液提取木瓜中的残留药物，再加入0.25%抗坏血酸衍生化；Satheshkuma等[13]采用0.1%甲酸乙腈溶液提取红茶中联苯肼酯残留；也有直接采用乙腈提取草莓[3]、柑橘[16]和土壤[16]中联苯肼酯残留的报道。韩凤等[16]比较了甲醇、乙酸乙酯、乙腈和二氧甲烷提取柑橘橘肉、果皮等的联苯肼酯残留，结果表明乙腈作为提取溶剂时，杂质较少，回收率稳定。由于茶叶基质更复杂，成茶茶叶为干物质，人体通过饮用茶汤摄入农药残留。因此，本实验采用茶叶加水充分浸泡后，再加入乙腈作为提取溶剂，以提取茶叶中的联苯肼酯残留。

QuEChERS是美国农业部Anastassiades 教授在2003年发明的一种前处理方法[17]，操作简单、快速，广泛应用于农药残留分析检测中[18-20]。前期研究[21-22]表明：PSA 能有效去除茶叶样品中的脂肪酸、糖类物质等极性基质；C18能去除部分非极性脂肪和脂溶性杂质；GCB能去除色素和固醇类杂质，降低杂质干扰与基质效应；加入MgSO4可吸收多余水分。因此，本实验采用100 mg PSA+50 mg GCB+200 mg MgSO4净化干茶，采用100 mg PSA+25 mg GCB+200 mg MgSO4净化鲜叶。既能去除大部分杂质，又能保证农药较好的回收率，且5.0 g鲜叶和2.0 g干茶分别仅需20、10 mL乙腈，节省了有机试剂的使用量，降低了实验成本。

2.2 色谱质谱条件的优化

茶叶中富含咖啡碱、色素等不同极性的杂质化合物，在紫外检测中易造成严重的背景干扰，无法获得更低的检测限。因此，为了获得良好的分离效果，采用0.1%甲酸乙腈和10 mmol/L乙酸铵溶液进行梯度洗脱，进一步降低杂质干扰和基质效应的影响。

本研究分别采用ESI+和ESI-电离分析联苯肼酯，结果表明，在ESI+模式下，联苯肼酯的离子化效果更好，能获得更高的[M+H]+响应。在实验过程中，进一步优化了锥孔电压(10、20、30、40、50 V)和喷雾电压，发现锥孔电压在20 V时的准分子离子峰[M+H]+(m/z301)响应最好。对准分子离子进行二级质谱裂解子离子扫描，不断增大二级质谱的裂解碰撞电压，得到碎片离子信息，并优化碰撞裂解能量(5、10、15、20、30、40 eV)，联苯肼酯准分子离子峰m/z301在5、10、20 eV下的二级质谱图示于图2。由图2可见，m/z301主要生成碎片子离子m/z198和m/z170，推测二者均是由六元环重排裂解生成，随着碰撞裂解电压的变化，离子丰度有所不同。利用四极杆飞行时间质谱通过源内裂解生成m/z198后，对其进行二级质谱裂解验证，发现m/z198的子离子为m/z152，未见m/z170。这进一步验证了m/z170并非来自m/z198，而是随着裂解能量的增强，由m/z301裂解生成，其主要碎片结构和裂解途径示于图3。最终优化后的条件已列于1.3.2和1.3.3节，选择子离子m/z198作为定量离子，m/z170用以辅助定性。

注：a.5 eV；b.10 eV；c.20 eV图2 不同二级碰撞能量下，联苯肼酯准分子离子峰m/z 301的二级质谱图Fig.2 MS/MS spectra of m/z 301 at different collision energies

图3 联苯肼酯准分子离子及其主要碎片离子的裂解路径Fig.3 Fragmentation pathway of the quasi-molecular ion of bifenazate

2.3 标准曲线、灵敏度、回收率与精密度

在优化条件下，考察了方法的线性关系，在0.002 5～1.0 mg/L浓度范围内，联苯肼酯的线性方程为y=1 505 413x+43 050，相关系数r=0.994 2。

按照1.5节条件进行添加回收率实验，同时配制相应浓度的基质标准溶液进行定量分析，回收率和相对标准偏差(RSD)列于表1。结果表明，在0.020、0.20、2.0 mg/kg 3个添加浓度下，绿茶中联苯肼酯的平均回收率分别为79.3%、88.6%和103.4%，RSD分别为6.1%、5.9%和3.7%；红茶中联苯肼酯的平均回收率分别为79.3%、82.6%和103.3%，RSD分别为6.7%、4.5%和4.7%；茶鲜叶中联苯肼酯的平均回收率分别为91.1%、94.4%和91.0%，RSD分别为4.3%、3.8%和7.6%。以最低添加浓度下方法检出限(LOD，S/N=3)为1.5 μg/kg，计算S/N=10时的方法定量限(LOQ)，联苯肼酯在茶鲜叶、绿茶和红茶中的方法定量限为5 μg/kg。茶叶空白样品、联苯肼酯绿茶基质标准样品和最低添加浓度样品的色谱图示于图4。

表1 茶鲜叶、绿茶和红茶中联苯肼酯的添加回收率和相对标准偏差Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of bifenazate residue in fresh tea leaves, green tea and black tea samples

图4 绿茶空白样品(a)、联苯肼酯绿茶基质0.004 mg/L标准样品(b)和最低添加浓度0.02 mg/kg样品(c)的色谱图Fig.4 Chromatograms of green tea blank sample (a), bifenazate matrix standard solution (b) and spiked green tea sample (c)

2.4 联苯肼酯在鲜叶上的消解动态

按照1.2.1节方法进行43%联苯肼酯悬浮剂在茶鲜叶上的残留消解动态实验，按照1.3节方法测定茶鲜叶中联苯肼酯的残留量，结果列于表2，鲜叶中联苯肼酯的消解动态曲线示于图5。

结果表明：由于茶叶生长状态不同，按实验剂量施药后，2013年茶叶鲜叶喷药2 h后联苯肼酯原始沉积量为21.291～54.789 mg/kg；喷药5天后，浙江、湖南、福建三地茶鲜叶中联苯肼酯消解均达到90%以上；三地茶鲜叶中联苯肼酯残留消解分别满足一级反应动力学方程y=7.835 6×10-0.237 7x、y=11.227×10-0.332 3x、y=12.81×10-0.401 1x，相关系数R2分别为0.757 1、0.929 9、0.960 2，半衰期T1/2分别为2.9、2.1、1.7天。2014年茶鲜叶施药2 h后联苯肼酯原始沉积量为5.333～11.876 mg/kg，由于三地气候等差别，喷药5天后，浙江和福建两地茶鲜叶中联苯肼酯消解率均达到90%以上，而湖南地区在喷药14天后茶鲜叶中联苯肼酯消解率才达到90%以上。浙江、湖南、福建三地茶鲜叶中联苯肼酯残留消解分别满足一级反应动力学方程y=3.714 0×10-0.338 6x、y=10.513 8×10-0.174 7x和y=3.196 8×10-0.486 6x，相关系数R2分别为0.892 0、0.982 5和0.869 9，半衰期T1/2分别为2.0、4.0、1.4天。

表2 43%联苯肼酯悬浮剂在茶叶鲜叶上的消解动态数据Table 2 Average dynamic degradation data of 43% bifenazate suspending agent in fresh tea leaves

2013～2014年夏秋季43%联苯肼酯悬浮剂在两年三地实验表明，联苯肼酯在茶鲜叶上的半衰期为1.4～4.0天，属于易降解农药。

2.5 联苯肼酯在茶叶中的最终残留结果

按照1.2.2节方法进行43%联苯肼酯悬浮剂在成茶茶叶中的最终残留实验，依照1.3节方法测定成茶中联苯肼酯的残留量。

结果表明，按照推荐剂量制剂30 g/亩(有效成分193.5 g/公顷)施药1、2次，间隔5天后成茶中联苯肼酯残留量为0.010～8.243 mg/kg，平均值为2.835 mg/kg，残留中值为1.725 mg/kg；间隔7天后成茶中联苯肼酯残留量为未检出～4.518 mg/kg，平均值为1.486 mg/kg，残留中值为1.025 mg/kg；间隔10天后成茶中联苯肼酯残留量为未检出～3.991 mg/kg，平均值为1.061 mg/kg，残留中值为0.480 mg/kg；间隔14天后成茶中联苯肼酯残留量为未检出～1.769 mg/kg，平均值为0.546 mg/kg，残留中值为0.340 mg/kg。

按照高剂量(1.5倍推荐剂量)制剂45 g/亩(有效成分290.25 g/公顷)施药1、2次，间隔5天后成茶中联苯肼酯残留量为0.011～10.501 mg/kg，平均值为3.824 mg/kg，残留中值为2.920 mg/kg；间隔7天后成茶中联苯肼酯残留量为0.006～5.977 mg/kg，平均值为1.819 mg/kg，残留中值为1.316 mg/kg；间隔10天后成茶中联苯肼酯残留量为未检出～4.547 mg/kg，平均值为1.164 mg/kg，残留中值为0.690 mg/kg；间隔14天后成茶中联苯肼酯残留量为未检出～2.038 mg/kg，平均值为0.701 mg/kg，残留中值为0.390 mg/kg。

实验表明，按照推荐剂量和1.5倍推荐剂量施药1～2次，10天后成茶中的联苯肼酯残留量均小于5 mg/kg。

注：a.浙江2013年；b.浙江2014年；c.湖南2013年；d.湖南2014年；e.福建2013年；f.福建2014年图5 43%联苯肼酯悬浮剂在浙江、湖南和福建三地2013～2014年茶鲜叶上的消解动态曲线Fig.5 Degradation kinetic curves of 43% bifenanzate SC in tea fresh leaves in 2013-2014 at Zhejiang, Hunan and Fujian

2.6 茶叶中联苯肼酯最大残留限量建议及饮用安全性风险评估

联苯肼酯的每日允许摄入量(ADI)值为0.01 mg/kg·d bw。如果以5 mg/kg设定为联苯肼酯在茶叶中的MRL值标准，按照茶叶全部摄入体内(实际上还应该考虑浸出率，浸出率并非100%)计算人体最大摄入量为：

0.001 032(mg/kg·d bw)

其中：LP为世界上每人每天饮用茶叶的最高值(13 g/d)；HR-P为理论上应该取假定安全间隔期10天的成茶中联苯肼酯最高残留量4.547 mg/kg，小于建议MRL值，故此处按照建议MRL值5 mg/kg来计算；BW为成人平均体重(63 kg)。

计算获得人体最大摄入量为0.001 032 mg/kg·d bw，该值仅为联苯肼酯ADI值(0.01 mg/kg·d bw)的10.32%，此处计算并未考虑茶汤中浸出率，若引入浸出率数据，则风险值更小。该结果表明，联苯肼酯在茶叶中的MRL值设定为5 mg/kg时，人体饮用安全系数大于10，可认为此条件下茶叶是安全的。

3 结论

本研究建立了QuEChERS分散固相萃取方法净化，超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定茶叶中联苯肼酯残留的分析方法，研究了43%联苯肼酯悬浮剂在茶园茶叶中的残留降解规律，并对其饮用安全性进行了风险评估。结果表明，按照风险评估制订茶叶中联苯肼酯残留量MRL值为5 mg/kg对人体饮用是安全的，人体通过全部食用茶叶摄入的联苯肼酯仅占每日允许摄入量(ADI)的10.32%。