表面活性剂结合QuEChERS-气相色谱-串联质谱法同时测定大豆油中有机氯农药、多氯联苯及多环芳烃

李晓贝，刘福光，周昌艳，陈珊珊

(上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室，上海 201403)

美国农业局及中国国家粮油信息中心统计结果显示，2015年全球大豆油消费量5 198万吨(占全球植物油消费量的29%，排名第二)，其中，中国大豆油消费量为1 450万吨，在中国植物油消费总量中稳居第一[1]。有机氯类农药(organochlorine pesticides, OCPs)、多氯联苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)及多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)均属于持续性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs)，脂溶性极强且难以降解，易在环境及生物体中富集，尤其可在动物脂肪组织中富集并产生危害性更大的代谢产物，对人体具有致畸、致癌性[2-7]。因此，许多国家对植物中的OCPs、PCBs、PAHs制定了最大残留限量值(maximum residue limit，MRL)，如我国GB 2763—2016规定大豆油中七氯的MRL为0.02 mg/kg，植物油中氯丹的MRL值为0.02 mg/kg[8]；GB 2762—2017规定油脂及其制品中苯并[α]芘的MRL值为0.01 mg/kg[9]；欧盟规定植物油中PCBs的MRL值为0.04 mg/kg[10]。基于OCPs、PCBs、PAHs的强脂溶性及植物油基质的复杂性，使得植物油中该类化合物的提取存在较大困难，至今尚无相应的国家标准，仅有的同时检测植物油中多种农药残留的相关行业标准SN/T4428—2016《出口油料中多种农药残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》[11]也不包含此类化合物。

目前，已报道的植物油中农药、PCBs、PAHs等残留量的提取净化方法有：凝胶渗透色谱法(GPC)、固相萃取法(SPE)、分散固相萃取法(d-SPE)、QuEChERS法(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe)、低温冷冻离心法、液-液分配萃取法(LLP)等；相应的检测仪器主要包括气相色谱仪(GC)、液相色谱仪(LC)、超高压液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)、气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS)等[12-16]。这些方法均存在操作复杂、有机溶剂使用量较大，有些只能针对同一类型的化合物进行检测，不能满足同时筛查植物油中多种痕量有机污染物的需求，有待进一步开发安全、快速的检测方法。

QuEChERS前处理方法广泛应用于植物性农产品的农药残留检测中，已有报道采用QuEChER方法测定植物油中有机磷类、氨基甲酸酯类等农药[16-17]，尚未见采用QuEChERS方法直接同时测定植物油中OCPs、PCBs及PAHs。为提高植物油中有机农药的提取效率，可将乙腈-水作为提取溶剂，但是油、水不互溶，无法形成均一稳定的溶液体系，使得提取效果不稳定。表面活性剂同时具有亲水基和疏水基，可通过降低疏水化合物与水的界面张力而形成稳定的悬浮液，广泛应用于乳油、水乳剂、微乳剂等多种农药剂型中[18]。在植物油/水混合溶液中加入表面活性剂，均质后形成稳定的乳状液，可增大植物油的分散度，同时降低提取过程中植物油的使用量及有机溶剂吸附的干扰物质量，目前尚未见在植物油农药残留的提取中使用表面活性剂的报道。

本研究拟以表面活性剂为乳化剂，制备相对稳定的油/水乳状液，并以乙腈-二甲苯为提取溶剂，基于QuEChERS前处理方法提取大豆油中OCPs、PCBs、PAHs，并通过GC-MS/MS进行检测，希望建立可同时快速检测大豆油中OCPs、PCBs、PAHs的方法，以期为国内植物油中此类物质的检测提供技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ 8000 Evo气相色谱-串联质谱仪，Sorval ST 16R高速离心机：美国Thermo Fisher公司产品；EOFO-945205涡旋仪：美国Talboys公司产品；SR-2 DW振荡器：日本Taitec公司产品；超纯水仪：英国ELGA PureLab公司产品。

乙腈、丙酮、正己烷、二甲苯：均为色谱级，上海安谱公司产品；聚乙二醇400(PEG400)、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、庚烷磺酸钠、3-(N,N-二甲基十二烷基铵)丙烷磺酸盐(硫代甜菜碱)、有机硅表面活性剂：国药集团化学试剂有限公司产品；无水硫酸镁(MgSO4)和氯化钠(NaCl)的盐包、EMR除油脂净化试剂包：美国Agilent公司产品；52种目标化合物标准品(纯度均高于96%)：德国Dr.Ehrenstorfer公司产品或美国AccuStandard公司产品。

每种标准品由丙酮或正己烷配制成1 000 mg/L的标准溶液，于-18 ℃下储存；并混合所有标准品溶液，用丙酮稀释为10 mg/L的混合标准溶液，于-18 ℃下储存，备用。

1.2 实验方法

1.2.1提取方法 准确称取1.00 g(±0.05 g)大豆油于50 mL离心管中，并加入2粒陶瓷均质子，如为添加的质控样品，加入一定量混合标准溶液，涡旋混匀后静置20 min。乙腈-二甲苯提取液(9∶1，V/V)及超纯水于4 ℃预冷备用。加入0.25%～4%(相对于植物油的质量比)的表面活性剂及3 mL冷水，涡旋振荡使其充分乳化；再加入5 mL提取液，涡旋15 s；之后迅速加入2 g MgSO4和0.5 g NaCl的提取盐包，手摇快速振荡约15 s，放热完全后，在机械振荡器上振荡15 min；然后于20 ℃以5 000 r/min离心10 min，取上层有机相；以5 mL提取液再重提1次。

1.2.2净化方法 将EMR Lipid净化试剂倒入50 mL离心管中，用10 mL水活化，合并2次吸取的上层有机相，并转移至该离心管中，涡旋混匀约30 s。在20 ℃下，以5 000 r/min离心10 min，此时溶液分层，上、下层澄清，中层为油层。将冷藏后的上、中、下层混合液转入50 mL含有6 g MgSO4和0.5 g NaCl的Polish盐析管中，涡旋30 s后，于20 ℃以5 000 r/min离心10 min。取5 mL上层净化液于干净的玻璃试管内，40 ℃氮吹近干，用1 mL丙酮复溶，涡旋混匀后，过0.22 μm滤膜，滤液置于1.5 mL进样小瓶中，待GC-MS/MS分析。

1.2.3色谱条件 色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；载气He，流速1.2 mL/min；升温程序：起始温度40 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min升至90 ℃，保持1.5 min，继续以25 ℃/min升至180 ℃，再以5 ℃/min升至280 ℃，最后以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；进样量1.0 μL；分流比10∶1。

1.2.4质谱条件 电子轰击电离源(EI源)；电离电压50 eV；离子源温度300 ℃；传输线温度300 ℃；碰撞气为氩气；选择反应监测模式(SRM)。52种化合物的质谱参数列于表1。

2 结果与讨论

2.1 表面活性剂的选择与优化

2.1.1表面活性剂种类的选择 表面活性剂按其亲水基团的性质可分为离子型表面活性剂(包括阳离子型、阴离子型及两性离子型)和非离子型表面活性剂两大类。离子型表面活性剂是亲水基团为羧酸、磺酸、硫酸或氨基及其盐等在水溶液中会发生电离的一类表面活性剂；非离子型表面活性剂则是分子中含有在水溶液中不发生电离的羟基、酰胺基或醚键为亲水基团的一类表面活性剂[19]。本实验选取8种具有代表性的表面活性剂进行研究(以水包油型(O/W)乳化剂为主，在提取过程中大豆油与水的比例为1∶3，添加表面活性剂后O/W型是较为合适的分散体系)，其性质列于表2。与相同条件下未添加表面活性剂的提取效果进行比较，考察表面活性剂的添加及其种类对添加回收率的影响。52种目标化合物混合标准品添加水平为100 μg/kg，各种表面活性剂的添加浓度均为1%(相对于大豆油的质量比，经实验，在此添加浓度下大豆油与水可充分乳化)。PCBs具有显著的疏水性，极易溶于植物油中，难以通过常规的提取方式进行充分提取，但其性质稳定且在质谱检测器上响应值较高。在添加的52种化合物中，PCBs回收率受提取条件变化的影响较为显著，因此选择其中7种典型PCBs为代表，以其回收率的变化趋势为指标进行表面活性剂的选择与优化，结果示于图1。

表1 52种有机氯农药、多氯联苯及多环芳烃类化合物的质谱参数Table 1 Mass parameters of 52 OCPs, PCBs and PAHs

续表1

续表1

注：*为定量离子对

由图1可见，使用未添加表面活性剂的QuEChERS前处理方法将大豆油提取3次后，其PCBs的添加回收率显著高于提取2次的回收率；而添加表面活性剂后，相同条件下提取2次的效果与未添加表面活性剂提取3次的效果在同一水平，表明表面活性剂的添加显著提高

了大豆油中PCBs的提取率。整体上，所选8种表面活性剂在提取2次的情况下均对PCBs的添加回收率有显著性提高，回收率受表面活性剂的亲水亲油平衡值(HLB)及化合物结构影响较大，而与其是离子型或非离子型表面活性剂无明显相关性。结合表2和图1可以看出，HLB值相对较低(HLB值越高亲水性越强)的庚烷磺酸钠及PEG400对提取率的提升效果相对较差，HLB值相对较高且与植物油有相似长链烷烃结构的十二烷基硫酸钠(SDS)及吐温系列对回收率有较好的提升效果。然而，吐温60(HLB 14.9)对提取率的提升效果略高于吐温20(HLB 16.7)及SDS(HLB 40)。有研究表明[20]，乳状液的粒度分布与乳化剂的HLB 值并无直接关系，说明在一定比例的油/水体系中，表面活性剂的HLB值达到一定需求后，对油中PCBs提取率影响更大的可能是表面活性剂的化学结构，具体的影响机制尚待进一步探索。售价上，Anzergent 3-12>SDS>吐温系列；安全性上，非离子型=双离子型>阴离子型>阳离子型。综合有效性、成本、安全性及操作简便性，选取Tween 60为最优的表面活性剂。

表2 8种表面活性剂的性质Table 2 Properties of 8 surfactants

注：*HLB值=乙氧基质量分数/5[21]；HLB值为8～18作为水包油(O/W)型乳化剂

图1 表面活性剂对大豆油中PCBs提取回收率的影响(添加水平为100 μg/kg)Fig.1 Effects of the adding of surfactants on the recoveries of PCBs in soybean oil (100 μg/kg)

2.1.2表面活性剂添加浓度的优化 表面活性剂达到一定的添加量才能获得稳定的油水乳状液，Tween 60的添加浓度对大豆油中PCBs提取回收率的影响示于图2。可见，PCBs的添加回收率随着Tween 60添加浓度的提升而显著提高，至添加浓度为1%时达到最高，然后随着添加浓度的持续提升而降低，但仍高于未添加Tween 60的对照组。在低浓度时，随着Tween 60浓度的增大，油滴在水中的分散性逐渐增大，PCBs的提取回收率也随之提高，直至达到平衡。但是，若继续增大Tween 60的添加量，可能会破坏乳状液的稳定分散体系，进而降低PCBs的提取回收率。综上，Tween 60的最佳添加浓度为1%。

图2 Tween 60的添加浓度对大豆油中PCBs提取回收率的影响(添加水平为100 μg/kg)Fig.2 Effects of Tween 60 with different concentrations on the recoveries of PCBs in soybean oil (100 μg/kg)

2.2 方法的线性范围、回收率、精密度、检出限和定量限

Tween 60添加浓度为1%时，以空白大豆油提取液为溶剂，分别配制1、2.5、5、10、20、50、100、200、400 μg/L的52种目标化合物的基质混合标准溶液。以标准溶液的浓度为横坐标(x)，相应峰面积的丰度值为纵坐标(y)绘制标准曲线，回归方程与线性相关系数列于表3，相关系数R2在0.993 8～0.999 7之间。

在大豆油空白样品中，添加5、20、100 μg/kg三个浓度水平的52种混合标准溶液，按照上述优化的实验方法进行添加回收率实验，每个添加浓度重复6次，考察方法的精密度。以3倍信噪比(S/N=3)计算方法的检出限(LOD)，满足添加回收率范围及RSD值的最低添加浓度为定量限(LOQ)[22]，各化合物的添加回收率及定量限、检出限列于表3。在5～100 μg/kg的添加浓度范围内，34种OCPs在大豆油中的添加回收率为64.35%～120.63%，相对标准偏差(RSD)为2.62%～20.50%；12种PCBs的添加回收率为49.65%～97.76%，RSD为1.59%～13.90%；6种PAHs的添加回收率为74.05%～101.52%，RSD为3.60%～18.16%。

添加浓度为5 μg/kg或10 μg/kg的大豆油加标样品中，52种化合物的定量离子SRM谱图示于图3。

注：*表示化合物添加浓度为10 μg/kg，其余化合物的添加浓度为5 μg/kg图3 加标大豆油中52种有机氯农药、多氯联苯及多环芳烃类化合物的定量离子SRM谱图Fig.3 SRM chromatograms of 52 kinds of OCPs, PCBs and PAHs in spiked soybean oil samples

3 结论

建立了气相色谱-串联质谱同时测定大豆油中34种有机氯农药(OCPs)、12种多氯联苯(PCBs)及6种多环芳烃(PAHs)残留量的检测方法。该方法以表面活性剂为乳化剂制备相对稳定的油/水乳状液，并以乙腈-二甲苯为提取溶剂，基于QuEChERS前处理方法对大豆油中的OCPs、PCBs、PAHs进行提取，通过GC-MS/MS进行检测。本方法以成熟的QuEChERS前处理方法为基础，操作简单、有机溶剂使用量低、油脂去除效果良好，灵敏度、精密度及回收率均可满足国内外相关标准对大豆油中相应残留限量的要求，可为国内植物油中此类有机农药的检测提供技术参考。