基于特征性子离子和中性丢失快速筛查和识别食品中唑类和有机磷类农药

郭天洋，李 杨，董益阳，白 桦，马 强

(1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.北京工商大学食品学院，北京 100048；3.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029)

农产品在种植过程中，通常会喷洒农药以预防病虫害，但如果喷洒时机不适宜，或超范围、超剂量使用农药，则容易产生农药残留问题[1]。根据作用类型，农药可分为唑类、有机磷类等。唑类农药用途广，可作为杀虫剂、杀真菌剂、除藻剂、植物生长延缓剂等[2-3]，包括三唑类、咪唑类、吡唑类等。其中，三唑类含有三唑基团；咪唑类和吡唑类分别含有咪唑基团和吡唑基团，二者互为同分异构体。有机磷类农药包括磷酸酯类和硫代磷酸酯类，大多具有剧毒和高毒，少数低毒，常被用作杀菌剂、杀虫剂、灭鼠剂等[4-5]。

质谱技术灵敏度高、特异性好、分析速度快、专属性强，近年来发展迅速。对于已知的农药组分，传统的质谱定性、定量分析方法通常使用农药标准物质[6]。但对于未知农药组分，标准物质很难及时获取，定性、定量难度较大，亟需寻求新的解决方案[7-8]。

2004年，Cooks教授[9]提出电喷雾解吸电离(desorption electrospray ionization, DESI)；2005年，Cody博士[10]提出实时直接分析(direct analysis in real time, DART)。这两项具有里程碑意义的敞开式离子化质谱技术(ambient ionization mass spectrometry, AIMS)[11]为质谱快速检测奠定了坚实基础。2010年，Cooks和Ouyang教授[12]提出纸喷雾电离(paper spray, PS)，将敞开式离子化技术简单化，无需色谱分离，大大提高了分析效率。近年来，AIMS的应用范围日益广泛，涵盖了食品安全[13]、临床医学[14]、环境监测[15]、工业品分析[16]、法医化学[17]等众多领域。

具有相似的官能团或化学结构的同一类待测物，在二级质谱碎裂过程中表现出相似的行为特征。通过归纳这些特征，有助于识别该类未知物的化学结构。有研究人员采用不同的敞开式离子化质谱技术基于中性丢失开展了相关研究。例如，He等[18]采用DART-MS基于共同的中性丢失CH3OH研究了甲基化的皂甙和低聚糖；Wang等[19]应用大气压固体分析探针(atmospheric pressure solids analysis probe, ASAP)，根据 H2O、CH2O、CO、CH3OH、CO2等中性丢失，分析煤相关的模型化合物。也有研究人员根据子离子信息开展相关研究，例如，Oradu等[20]使用PS-MS根据子离子磷酸胆碱研究极性脂质。为提高定性分析的准确性，除了可以采用二级或多级质量分析器来增加质谱碎裂次数，还可使用飞行时间(time-of-flight, TOF)或静电场轨道阱(Orbitrap)质量分析器以提高质谱分辨率[21]。四极杆与静电场轨道阱质量分析器的联用(quadrupole-Orbitrap, Q-Orbitrap)不仅可以得到高分辨的一级质谱信息，同时还可以得到对应的高分辨二级质谱信息，由此区分质荷比相似的待测物，从而排除假阳性和假阴性信息，提高检测结果的可靠性[22]。

本研究拟建立基于中性丢失和子离子的敞开式离子化技术结合高分辨二级质谱的分析方法，用于识别和筛查食品中唑类和有机磷类农药，希望为食品中农药检测提供新方法和新思路。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪：美国Thermo公司产品，配有TraceFinder Version 4.0数据采集和处理系统；DART敞开式离子源：美国IonSense公司产品，接口与Q Exactive质谱仪配套，配有12位玻璃棒进样模块和10孔筛网透射进样模块；PS离子源：自行搭建，由一个鳄鱼形铜夹和一片三角形色谱纸(长12 mm×高18 mm)组成，通过连接鳄鱼形铜夹与高压电源，将喷雾溶剂施加于三角形色谱纸底部。

将Q Exactive质谱仪的质量分析器每周用调谐液调谐一次。在使用DART之前，质谱离子源接口换成自带VAPUR接口，连接真空泵，安装之后识别成NSI源。使用PS之前，需要连接电阻模块，以便识别成NSI源。质谱数据分别在正离子模式和负离子模式下进行采集。

1.2 主要材料与试剂

甲醇、乙腈、丙酮、甲苯：色谱纯，美国Fisher Scientific公司产品；咪唑类、吡唑类、三唑类、有机磷类农药标准品：均为德国Dr. Ehrenstorfer公司产品，于-20 ℃储存；用于DART载气的高纯氦气和用于质谱干燥气的高纯液氮：北京氦普北分气体工业有限公司产品；Whatman 1ET色谱纸：美国GE公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1离子化条件 毛细管温度：320 ℃；微扫描次数：1；PS喷雾电压：3.5 kV；反向干燥气流速：2 L/min ；默认电荷态：1；DART载气温度：350 ℃；载气流速：2.7 L/min；泵吸力：-90 kPa；DART口与陶瓷管入口间距：25 mm；陶瓷管出口与质谱毛细管入口间距：1 mm。

1.3.2质谱采集条件 全扫描(full scan, FS)模式：分辨率70 000；自动增益控制(AGC target)：1×106；离子最大注入时间50 ms；质量扫描范围m/z50～750。全离子碎裂(all-ion fragmentation, AIF)模式：分辨率70 000；自动增益控制1×106；离子最大注入时间50 ms；质量扫描范围m/z50～750；阶梯(归一化)碰撞能量(stepped (N)CE)25、35、45 eV。二级质谱(MS2)参数：分辨率35 000；自动增益控制2×105；离子最大注入时间50 ms；循环次数为1；TopN为10；隔离窗口m/z0.4；阶梯(归一化)碰撞能量25、35、45 eV。数据依赖采集设定参数：最小自动增益控制1×104；触发值2×105；动态排除120 s。

1.4 基于子离子和中性丢失的识别和筛查

子离子和中性丢失均是待测物在质谱中的特征反应，大部分农药的母离子和对应的子离子通常都带有1个电荷。此时，中性丢失的质量数是母离子和子离子质量数的差值，即母离子失去1个中性丢失得到子离子，中性丢失不带电。研究子离子和中性丢失，可以在数据采集或处理过程中实现。

在数据采集过程中，可使用三重四极杆(triple quadrupole, QqQ)质量分析器检测，分别采用子离子扫描模式和中性丢失扫描模式得到特征子离子和中性丢失信息。但QqQ质量分析器的分辨率较低，容易出现假阳性或假阴性结果。Q-Orbitrap作为高分辨质量分析器，可以完成更精准的中性丢失筛选。具体操作为：使用TraceFinder软件自带的FS MS/AIF/NL dd-MS2组合模式，先进行全扫描，再进行全离子碎裂;然后，根据FS和AIF的差值自动选择符合中性丢失规则的母离子，若无，则为阴性,若有，则为阳性;最后，通过dd-MS2模式进行二级质谱分析。

在数据处理过程中，可利用敞开式离子源无需色谱分离的特点，通过FS和AIF模式得到所有待测物的母离子和子离子。通过软件处理，可以得到所有的中性丢失，并排除不符合要求的中性丢失。根据子离子和中性丢失可以实现已知农药的筛查和未知农药的识别。

1.5 不同样品的敞开式离子化方式

不同类型的食品样品可采用不同的敞开式离子化方式。若使用DART-Q-Orbitrap HRMS检测，液体样品需要进行液-液萃取，如果基质较复杂，可使用QuEChERS制样方式；粉末固体样品需要通过乙腈溶剂进行固-液萃取，或者压片后直接进行DART检测；块状固体样品可用DART直接检测，必要时配合适宜的解吸附方法，如加热、溶剂喷雾、激光辅助等；气体样品可通过固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)吸附，然后进行DART检测；气溶胶样品可喷到DART筛网上进样分析。若使用PS-Q-Orbitrap HRMS检测，液体样品可以直接进样或者经稀释萃取后加样至三角形纸基上进样分析，也可以利用色谱纸介质吸附基质，先点样于纸基上，干燥后加入解吸溶剂进样分析；固体和半固体样品可涂抹于三角形纸基上，加入解吸溶剂进样分析；块状固体可剪出尖，滴加解吸溶剂喷雾进样分析；气溶胶样品可喷至三角形纸基上，滴加解吸溶剂喷雾进样分析。

2 结果与讨论

本研究提到的中性丢失包括共性特征中性丢失(如唑环)、辅助定性中性丢失(如甲基)和农药特有中性丢失(待测物高响应的子离子对应的中性丢失)；子离子包括共性特征子离子(如质子化的唑环)、辅助定性子离子(如质子化的甲基)和农药特有子离子(待测物高响应对应的子离子)。

2.1 唑类农药特征子离子和中性丢失

唑类结构是含有氮原子和至少1个非碳原子(氮、硫、氧)的五元杂环，含有2个双键，包括只含氮的咪唑、吡唑、三唑等，含有氮和氧的恶唑、异恶唑、恶二唑，以及含有氮和硫的噻唑、异噻唑、噻二唑等。农药中常见的咪唑、吡唑和三唑结构示于图1。

图1 咪唑(a)、吡唑(b)、1,2,3-三唑(c)和1,2,4-三唑(d)的化学结构式Fig.1 Chemical structures of imidazole (a), pyrazole (b), 1,2,3-triazole (c) and 1,2,4-triazole (d)

三唑类农药均含有三唑基团，其分子式为C2H3N3，精确分子质量为69.032 70，质子化的三唑([M+H]+)为C2H4N3+，精确质荷比为70.039 97。在高分辨二级质谱中，大部分三唑类农药均产生质子化的三唑离子([M+H]+)，少数三唑类农药产生三唑(M)中性丢失。因此，根据共性特征子离子m/z70.039 97和共性特征中性丢失69.032 70即可对三唑类农药进行筛查和识别，结果列于表1。此外，含有三唑环的同系物也有类似的共性特征中性丢失，即C2H3N3(CH2)m，据此可间接推算三唑类农药的归属。

咪唑和吡唑互为同分异构体，分子式均为C3H4N2，精确分子质量为68.037 45，质子化的咪唑和吡唑([M+H]+)均为C3H5N2+，精确质荷比为69.044 72。同理，根据共性特征子离子m/z69.044 72和共性特征中性丢失 68.037 45即可对咪唑或吡唑类农药进行筛查。

表1 唑类农药的共性特征中性丢失和子离子Table 1 Common characteristic neutral losses and product ions of azole pesticides

注：*为同系物的中性丢失/子离子增加(CH2)m，精确质量/质荷比增加14.015 10m，m=0,1,2…

此外，本研究整理了三唑、咪唑、吡唑类农药的其他常见中性丢失结构，这些信息可用于未知唑类农药的辅助定性，相关基团包括苯基、氯苯基、二氯苯基、氟苯基、硅烷基等，结果列于表2。

表2 唑类农药的辅助定性子离子Table 2 Auxilliary qualitative product ions of azole pesticides

2.2 有机磷类农药特征子离子和中性丢失

有机磷类农药包括磷酸酯类和硫代磷酸酯类，其分子式为(P=Z)(OR1)(OR2)X，结构示于图2。其中，Z为氧或硫，一般R1和R2相同，多为甲氧基(—OCH3)或乙氧基(—OC2H5)，也可为丙氧基(—OC3H7)、甲硫基(—SCH3)或乙硫基(—SC2H5)等，X为烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫或其他取代基团。磷连接的基团不同，通常毒性也不同。例如，乙氧基比甲氧基毒性强，强酸根比弱酸根毒性强，氧原子比硫原子毒性强。

图2 有机磷农药的化学结构Fig.2 Chemical structure of organophosphorus pesticides

在二级质谱模式下，有机磷农药可能产生多种共性特征中性丢失和子离子，如PO4H3(CH2)m、PO3SH3(CH2)m、PO2S2H3(CH2)m、PO3H(CH2)m、PO2SH(CH2)m、POS2H(CH2)m、POSH(CH2)m等，结果列于表3。其中，质子化的磷酸根离子[PO4H3+H]+(m/z98.984 17)是大部分生物组分的二级子离子，不是有机磷农药的特有离子，予以排除。值得注意的是，有些子离子比较特殊，如子离子m/z171.023 93可能是[(P=S)(EtO)2OH+H]+、[(P=O)(EtO)2SH+H]+，或由[(P=S)(EtO)2SH+H]+氧化得到。

此外，还整理了有机磷类农药常见的辅助定性中性丢失和子离子，结果列于表4，这些结构可以辅助定性未知有机磷农药。中性丢失包括同系物(CH2)m、H2O(CH2)m、H2S(CH2)m、NH3(CH2)m，子离子包括C6H5CH2+、C6H5S+、C6H5OH+等。

表3 有机磷类农药的共性特征中性丢失和子离子Table 3 Common characteristic neutral losses and product ions of organophosphorus pesticides

注：*为同系物的中性丢失/子离子增加(CH2)m，精确质量/质荷比增加14.015 10m，m=0,1,2…

表4 有机磷类农药的辅助定性中性丢失和子离子Table 4 Auxilliary qualitative neutral losses and product ions of organophosphorus pesticides

注：*为同系物的中性丢失/子离子增加(CH2)m，精确质量/质荷比增加14.015 10m，m=0,1,2…

图3 唑类农药(腈菌唑)的全碎裂质谱图Fig.3 Full ion fragmentation spectrum of azole pesticide (myclobutanil)

2.3 筛查和识别唑类和有机磷类农药

建立了唑类农药和有机磷类农药的共性特征子离子和中性丢失库，以及辅助定性子离子和中性丢失库，用于子离子和中性丢失的检索。

本实验在数据处理过程中研究子离子和中性丢失。数据采集分为两个阶段：一是全扫描阶段，得到全部待测物的母离子；二是全离子碎裂阶段，得到全部待测物的全部子离子。每个时间段至少有10个采样点，保证待测物检测的重现性[23]。PS持续进样分析，DART可持续进样或匀速进样模块取出峰位置的平均值。对于复杂基质样品，可按质量范围分段进行。

将采集的高分辨一级和二级质谱数据采用Python软件进行处理。首先，将得到的全扫描数据去掉重同位素峰，只保留轻同位素峰；去掉多聚体峰，只保留单体；将[M+Na]+、[M+K]+和[M+NH4]+的母离子全部转化为[M+H]+。然后，将得到的母离子和子离子逐对相减，分别得到中性丢失。将全部子离子和中性丢失在对应的数据库中检索，筛查已知农药，识别未知农药。

代表性的唑类农药腈菌唑的全碎裂质谱图示于图3。其最高响应强度子离子m/z70.040 66为质子化的唑环，次高响应强度子离子m/z125.015 19为辅助定性子离子，符合相关规律。

9种有机磷类农药的全扫描和全碎裂质谱图示于图4。由图可见，有机磷类农药的母离子多为[M+H]+和[M+Na]+，子离子包含共性特征和辅助定性子离子，m/z114.961 28、127.015 25、142.992 22出现频次较高，符合相关规律。相似地，中性丢失包含共性特征和辅助定性中性丢失，m/z136.028 38、141.984 80出现频次较高，符合相关规律。

按照上述流程，根据质谱库识别了不同食品样品(葡萄酒、苹果、大米)中的农药，结果表明，未发现已知农药和未知农药。

注：1.甲胺磷；2.氧化乐果；3.敌敌畏；4.乐果；5.甲拌磷；6.水胺硫磷；7.喹硫磷；8.二嗪农；9.马拉硫磷；“’”表示相应的子离子图4 9种有机磷类农药的全扫描(a)和全碎裂(b)质谱图Fig.4 Full scan spectrum (a) and all-ion fragmentation spectrum (b) of 9 organophosphorus pesticides

3 结论

本研究基于待测物在敞开式离子化高分辨二级质谱中的子离子和中性丢失，建立了筛查已知农药和识别未知农药的快速分析方法。通过归纳唑类农药(三唑类、咪唑、吡唑)和有机磷类农药的化学结构及质谱碎裂行为，得到两类农药的数据库，包括共性特征子离子和中性丢失库，以及辅助定性子离子和中性丢失库。将敞开式离子化技术与高分辨质谱联用，可快速得到待测物的母离子、子离子和中性丢失信息，经数据处理，筛查和识别农药成分。该方法准确可靠，适用于食品中农药的筛查识别。