超高压液相色谱-串联质谱法快速测定牛肉、牛肾中3种甾类同化激素药物残留量

王 飞，宓捷波，葛含光

(天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津 300461)

群勃龙、睾酮、黄体酮均属于甾类同化激素药物，是比较重要的性激素。同化激素能增强体内物质沉积、改善生产性能，被广泛应用于畜牧养殖业，尤其是反刍动物养殖中[1]。多数激素类物质具有潜在的致癌效应[2-3]，长期摄入同化激素会导致机体代谢紊乱、发育异常或肿瘤。鉴于此，我国于1988年6月发布的《兽药管理条例实施细则》中规定“不得添加激素类药品”[4]；农业部规定在所有食品动物中禁止使用群勃龙[5]。但由于经济利益的驱使，违法滥用现象仍较普遍，为了保障我国进出口动物源食品的安全和人民的身体健康，对同化激素的残留监测势在必行。

目前，对甾类同化激素多残留检测的方法主要有免疫分析法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等，多以检测血浆、尿液等样品中甾类激素代谢物为主，而动物源性食品中原型药物的检测研究工作较少。同化激素类药物在肝、肾和脂肪组织中残留量较高，以原型药物为主[6]，而在肌肉和血浆中残留量较低，因此开发动物源性食品中甾类同化激素原型药物的检测方法具有重要的现实意义。液相色谱-质谱联用法作为检测同化激素的重要手段之一，能够满足痕量和超痕量激素残留的分析要求，对于食品检测、临床诊断和基础研究具有重要意义[7]。

本研究拟以叔丁基甲醚为提取溶剂，经过简单的前处理，结合超高压液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)快速检测牛肉、牛肾中的群勃龙、睾酮、黄体酮。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

API 4000+质谱仪：美国AB Sciex公司产品；Agilent 1290超高压液相色谱仪：美国Agilent公司产品；Avanti J-26XPI离心机：美国Beckman Coulter公司产品；N-EVAP 112 24针氮吹仪：美国Organomation公司产品；Milli-Q纯水仪：美国Millipore公司产品。

1.2 主要材料与试剂

群勃龙、黄体酮、睾酮固醇激素类标准品：纯度>95%，德国Dr.Ehrenstorfer公司产品；乙腈、甲酸、叔丁基甲醚：色谱纯，迪马科技公司产品；碳酸钠等其他试剂：均为国产分析纯；实验用水：由Milli-Q纯水系统制备。

1.3 实验条件

1.3.1样品前处理方法 准确称取5 g样品(精确至0.05 g)于50 mL离心管中，加入3 mL 10%碳酸钠溶液和15 mL 叔丁基甲醚，均质30 s，以10 mL叔丁基甲醚润洗刀头，合并均质溶液。振荡溶液10 min，以4 200 r/min 离心10 min，将上清液转移至离心管中，氮气吹干。用2.0 mL 50%乙腈-水溶液(含0.1%甲酸)溶解残余物，涡旋混匀，于-20 ℃冷冻30 min，然后以12 000 r/min 离心5 min，取适量溶液过0.22 μm有机微孔滤膜，待超高压液相色谱-串联质谱仪测试。

1.3.2基质工作曲线的绘制 用基质空白溶液分别将群勃龙、睾酮、黄体酮3种标准储备液(牛肉、牛肾)稀释为0.0、1.25、2.5、5.0、20.0、50.0 μg/L的系列标准溶液，进样测定，以离子色谱图中各组分的峰面积定量，绘制基质工作曲线。

1.3.3色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm×1.8 μm)；流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为乙腈；柱温20 ℃；进样量10 μL。梯度洗脱程序列于表1。

表1 3种甾类同化激素药物的梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution program of three hormones

1.3.4质谱条件 ESI正离子模式；毛细管电压5.5 kV；离子源温度600 ℃；多反应监测模式扫描；其他质谱条件参数列于表2。

表2 3种甾类同化激素药物的质谱检测条件Table 2 MS/MS parameters of three hormones

注：*表示以子离子及其前体离子为定量离子对

2 结果与讨论

2.1 前处理及检测条件的优化

2.1.1浸提溶液及净化方式的优化 群勃龙、睾酮、黄体酮均属脂溶性化合物，极性较弱，难溶于水，易溶于极性有机溶剂。在文献报道中，往往以乙腈[8]、乙酸乙酯[9]、酸化甲醇[10-11]、叔丁基甲醚[12]等为提取溶剂，再以固相萃取小柱，如C18柱[13]、HLB柱[14]等进行净化。

由于本实验采用外标法定量，为尽可能减少前处理步骤，使用了高效率的浸提溶剂，以减少样品损失，这是提高方法检出限的关键因素。实验比较了以叔丁基甲醚、乙腈、乙酸乙酯为提取溶剂，以阳离子交换柱为净化柱，以牛肉为加标基质的前处理方法。结果表明，以叔丁基甲醚为提取溶剂能得到更好的加标回收率。实验尝试了去除固相萃取柱净化步骤，单纯采用液液分配的方法，以叔丁基甲醚为提取溶剂，对牛肉基质中的3种甾类同化激素进行加标回收实验。结果表明，在以叔丁基甲醚为提取溶剂的情况下，既使没有净化柱，依然能得到较高的加标回收率，基质干扰影响较小。但是，在样品基质更为复杂(如牛肾脏样品)，尤其是油脂较多的情况下，不经净化分离直接检测，难免会对仪器造成污染。因此，实验尝试了采用旋蒸后对样品进行低温冷冻，再离心除脂的方法，既达到了净化的目的，又缩短了前处理时间。

2.1.2流动相的选择 本实验使用0.1%甲酸-水溶液和乙腈作为流动相，梯度洗脱，能够将3种目标分析物基线分离。含有低浓度甲酸的溶剂有利于电喷雾离子化，通过多反应监测色谱图，可对3种甾类同化激素进行较好地定性和定量分析。因为这3种甾类同化激素药物属于脂溶性物质，极性相对较小，故在最初的梯度中将水相的比例提高至98%，保证目标分析物在色谱柱上充分保留，梯度洗脱的详细信息已在表1中列出。

2.1.3质谱条件的优化 将群勃龙、睾酮、黄体酮标准溶液注入离子源，在正离子模式下对3种甾类同化激素药物进行串联质谱分析，分别对碰撞气能量、电喷雾电压、雾化气压力进行优化，使分子离子与特征碎片离子对信号强度的响应值达到最佳，其检测条件已列于表2。3种甾类同化激素(50 μg/L的混合标准溶液)的多反应监测色谱图示于图1，可以看出，3种同化激素在2.0～3.0 min内依次出峰，峰形良好。

2.2 方法学论证

2.2.1基质标准曲线的绘制

分别吸取0、25、50、200、500 μL，0.1 mg/L的标准储备液，N2吹干后，以基质空白溶液定容至1 mL，最终得到浓度分别为0、2.5、5.0、20.0、50.0 μg/L的基质标准溶液。在牛肉和牛肾基质中，3种甾类同化激素均表现出良好的线性关系，相关系数均大于0.996 7，其线性方程及相关系数列于表3。

图1 3种甾类同化激素(5 μg/L混合标准溶液)的多反应监测色谱图Fig.1 MRM chromatogram of three hormones(5 μg/L standard solution)

2.2.2干扰性实验 分别取空白牛肉、牛肾基质，按照1.3.1节方法进行前处理，之后进行质谱检测，结果示于图2。结果表明，实验用牛肉、牛肾基质中不含有3种甾类同化激素物质，能够以该基质进行添加回收实验。

表3 3种甾类同化激素物质的线性方程和相关系数Table 3 Regression equations and correlation coefficients (r) of three hormones

图2 牛肉(a)、牛肾(b)空白样品的多反应监测色谱图Fig.2 MRM chromatograms of blank samples of beef (a) and kidney (b)

2.2.3回收率及精密度实验 在空白牛肉和牛肾基质中分别添加1.0、2.0、10.0 μg/kg 3个浓度水平的3种甾类同化激素物质的混合标准溶液，进行6次平行测定，结果列于表4。可以看出，在牛肉和牛肾基质中，3个浓度水平的3种甾类同化激素物质均得到较好的回收，回收率在74%～83%范围内。在平行测定过程中，方法的重现性良好，变异系数小于10%。

2.2.4实际样品检测结果 日常检测中，在牛肉及牛内脏组织样品中检测到黄体酮阳性，6个阳性样品的名称及黄体酮的含量列于表5，其多反应监测色谱图示于图3。从图谱可见，本实验建立的方法适用于黄体酮检测。黄体酮是内源性激素，目前国内及国际上尚未对其限量进行明确规定。

表4 3种甾类同化激素物质的回收率及其精密度Table 4 Recoveries and precisions of three hormones

表5 阳性样品名称及黄体酮含量Table 5 Names of the positive samples and progesterone contents

注：黄体酮被检出图3 阳性样品的多反应监测色谱图Fig.3 MRM chromatograms of positive samples

3 结论

本研究建立了一种以叔丁基甲醚为提取溶剂，无需固相萃取净化，直接采用超高压液相色谱-串联质谱快速检测牛肉和牛肾中3种甾类同化激素的方法。结果表明，3种甾类同化激素在0.0～50.0 μg/L浓度范围内的线性关系良好，相关系数大于0.996 7。在1.0、2.0、10.0 μg/kg 3个浓度水平对牛肉和牛肾基质做添加回收实验，以外标法定量，平均回收率为74%～83%，相对标准偏差小于10%。该方法操作简便、回收率高，阳性样品检出准确，适用于大批量样品的快速检测。