沙葱水提液体外抗氧化及α-葡萄糖苷酶与胰脂肪酶抑制作用的研究

王婉愉，李姣，王霄凯，张晓峰，吕全军

（郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，河南郑州450001）

沙葱（Allium mongolicum Regel）属被子植物门（Angiospermae），百合科（Liliaceae），葱属（Allium），学名“蒙古韭”，主要生长在内蒙古、青海、甘肃、新疆等无污染的沙漠地区，是一种极具特色的野生蔬菜[1]。沙葱口感鲜嫩，具有较高的营养价值和药用价值，是草原人们喜爱的天然佳蔬，享有“大漠野菜”、“草原佳蔬”等美誉[2]。据蒙药典记载：沙葱具有降血压、降血脂、开胃消食、缓解口腻等功效[3]。近年来，葱属植物作为低毒植物药，其生理保健功能已得到广泛关注，具有预防心血管疾病、抗氧化、抗肿瘤、改善糖代谢等作用，具有很大的潜在开发价值[4]。沙葱作为草原的重要野生植物，以其独特的风味、丰富的营养价值、并且绿色无毒副作用越来越受到人们的青睐[5]。

目前沙葱的相关研究多集中于对其主要活性成分的提取、分离鉴定和对动物机能的改善方面，关于α-葡萄糖苷酶抑制活性和胰脂肪酶抑制活性的研究鲜有报道。本研究以沙葱为原料，通过测定沙葱水提液的总黄酮含量、DPPH自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶活性和胰脂肪酶活性的抑制作用，来探讨沙葱的体外抗氧化以及其在调节糖脂代谢方面的潜在功效，以期为沙葱的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜沙葱：于2017年9月20日购于内蒙古阿拉善，经郑州大学药学院中药教研室教授鉴定为百合科植物沙葱（Allium mongolicum Regel）。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、α-葡萄糖苷酶（酶活力≥10U/mg）、胰脂肪酶（酶活力 30 U/mg～90 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸水合物（N-Hippuryl-His-Leu hydratepowder，HHL）：美国 Sigma 公司；奎诺二甲基丙烯酸酯（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox）、Tris-HCL、槲皮素：上海阿拉丁试剂公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LGJ-18B冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司；10-2BS电热鼓风干燥箱：天津市华北实验仪器有限公司；RE-2000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；Centrifuge 5418高速离心机：艾本德中国有限公司；QL-901涡旋混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Spectra Max M2e多功能微孔板读数仪：美谷分子仪器（上海）有限公司；AL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 沙葱样品的处理

沙葱用纯水清洗后沥干水分，放置于真空冷冻干燥机中进行干燥。取干燥样品粉碎成粉，过60目筛，用四氯甲烷[质量体积比=1 ∶10（g/mL）]脱脂 24 h，抽滤后置于通风处晾干。称取10 g脱脂干粉，加入100 mL纯水，常温下浸提24 h，抽滤，滤渣重复上述步骤2次，合并2次提取的滤液，于循环水式蒸发仪浓缩至液体剩余20 mL，相当于10 g脱脂干粉最终溶解在20 mL的溶剂中，提取液浓度即为500 mg/mL。作为待测提取液，4℃保存备用。

吸附过程从本质上说是一个浓缩富集工艺。吸附、脱附是依靠吸附剂的物理和化学吸附作用，把废气中的有机物吸附下来，从而达到净化废气的目的。吸附剂进行吸附只是把有机物吸附下来，并没有把有机物真正转化为无害的物质，并且吸附到一定程度会达到饱和，所以通常必须进行脱附再生。脱附的方法有饱和蒸汽脱附溶剂回收法、热空气脱附溶剂回收法和催化燃烧热空气脱附法。

1.3.2 黄酮含量的测定

采用改进的Dowd[11]方法测定总黄酮含量（total flavonoid content，TFC），以槲皮素为标准品绘制标准曲线。取100 μL待测提取液，梯度稀释，加入等量2%AlCl3甲醇溶液，于25℃静置10 min。于415 nm波长处测定其吸光度。提取液的黄酮含量以槲皮素当量（quercetin equivalent，QE）为标准进行定量，最终的黄酮含量以每克干粉所含的槲皮素当量表示（mgQE/gDW）。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的测定[12]

于96微孔板中加入100 μL不同浓度的待测提取液，随后加入100 μL 0.208 mmol/L DPPH甲醇溶液，室温下避光静置40 min后于517 nm处测定吸光度。以不同浓度的Trolox甲醇溶液为标准对照，不同样品相应DPPH自由基清除能力表示为mg Trolox equivalent（TE）/g DW，即 Trolox等价抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）。样品对DPPH自由基的清除率计算如（公式1）所示：

式中：Ac为对照组（100 μL DPPH 溶液+100 μL 甲醇溶液）在517 nm处的吸光度；Ai为100 μL样品液+100 μL DPPH溶液在517 nm处的吸光度；Aj为100 μL样品液+100 μL甲醇溶液在517 nm处的吸光度。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定[13]

α-葡萄糖苷酶可以水解PNPG生成对硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP），pNP在碱性条件下 405 nm 波长处有最大吸收值，利用酶标仪测定其浓度，从而可以检测加入样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。α-葡萄糖苷酶溶液与PNPG底物溶液均由0.1mol/L磷酸钾缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=6.8）。根据 α-葡萄糖苷酶活性抑制模型：在96孔板中加入8 μL待测提取液，梯度稀释，随后加入112 μL 0.1 mol/L PBS与 20 μL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃恒温条件下放置15 min后加入20 μL 2.5 mmol/L PNPG底物溶液，37℃恒温反应15 min。最后加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，于405 nm波长处测定吸光度（A样），每个样品平行测定3次。同时设定相同条件下以磷酸钾缓冲液替代α-葡萄糖苷酶溶液的样品空白组（A样空），不加样品的阴性对照（A阴），不加样品、酶的空白对照组（A空）。水提液α-葡萄糖苷酶活性的抑制率计算方法如（公式2）所示。并求出相应的IC50值。

1.3.5 胰脂肪酶抑制活性的测定[14]

胰脂肪酶水解对硝基苯基月桂酸酯（pNP laurate）产生4-硝基苯酚（4-nitrophenol，PNP），PNP 在水溶液中显黄色，在405nm处有最大吸收峰。通过测定405nm处PNP的量来评定样品的脂肪酶抑制活性。底物溶液与酶溶液的配制：称取0.08 g对硝基苯基月桂酸酯，溶于100 mL 5 mmol/L乙酸钠溶液（pH=5.0，含1%曲拉通x-100），配制成8 g/100 mL的pNP laurate溶液，使用前放入沸水中溶解1 min，放置到室温；胰脂肪酶用蒸馏水溶解配成 10 mg/mL，4℃，13 000 r/min，离心5 min后取上清液。具体试验操作步骤为：在1.5 mL离心管中加入50 μL待测提取液，梯度稀释，随后加入150 μL 10 mg/mL 胰脂肪酶液与 350 μL 0.1 mol/L Tris-HCL缓冲液（pH=8.2），于 37℃预热 10 min，随后加入450 μL底物溶液开始反应，于37℃反应2 h。反应结束后，16 000 r/min离心3 min，取上清液加入96孔板，于405 nm处测定吸光值（A样），每个样品平行测定3次。同时设定相同条件下以Tris-HCL缓冲液替代胰脂肪酶溶液的样品空白组（A样空），不加样品的阴性对照（A阴），不加样品、酶的空白对照组（A空）。水提液胰脂肪酶活性的抑制率计算方法如（公式3）所示。并求出相应的IC50值。

1.3.6 观察指标及评判标准

本研究DPPH自由基清除试验与酶活性抑制试验中以IC50值即自由基（酶活性）被清除（抑制）一半时所需的样品质量浓度为观察指标。计算方法：以自由基清除率（酶活性抑制率）为纵坐标、样品液的质量浓度为横坐标作线性回归，从回归曲线的置信限制中读出概率为0.50的估算浓度即为IC50值。IC50值指清除率（抑制率）达50%时所需的样品质量浓度。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel软件进行数据统计与分析，所有试验均重复3次，结果以平均值±标准误差表示（±SD）。

2 结果与分析

2.1 沙葱水提液中的黄酮含量

以槲皮素的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制的标准曲线如图1所示。

图1 槲皮素标准曲线Fig.1 Quercetin standard curve for TPC analysis

由图1可知，标准曲线方程为y=0.009 9x+0.073 8（R2=0.999），说明槲皮素在 0～200 μg/mL质量浓度范围内与吸光度具有良好的线性关系；测定得到沙葱水提液中的黄酮含量为4.02 mg QE/g DW。

2.2 沙葱水提液对DPPH自由基的清除能力

Trolox标准曲线如图2所示。

图2 Trolox标准曲线Fig.2 The standard curve of Trolox

由图2可见，以Trolox标准溶液的质量浓度为横坐标，对DPPH自由基的清除率为纵坐标，标准曲线方程为 y=0.597 1x+22.164（R2=0.999），说明 Trolox 标准溶液在0～150 μg/mL质量浓度范围内与其对DPPH自由基的清除率具有良好的线性关系。测定得到的沙葱水提物的Trolox等价抗氧化能力为51.82 mg Trolox/g。

沙葱水提液在不同浓度下的DPPH自由基清除活性如表1所示。

沙葱水提液对DPPH自由基清除作用的IC50拟合曲线如图3所示。

图3 沙葱水提液的DPPH自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of Allium mongolicum Regel aqueous extract on DPPH radicals

DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，根据自由基的清除情况可评价物质的抗氧化能力，DPPH·乙醇溶液呈特征性的紫红色，加入受试物后，其颜色会逐渐变浅，因此在517 nm处可以动态的检测其对DPPH·的清除效果[15]。由表1可知，沙葱水提液质量浓度在0.39 mg/mL～3.13 mg/mL时，其清除DPPH自由基的能力随着质量浓度的增大而增大，说明其在此浓度范围内自由基清除能力与水提液浓度有明显的相关性，并且各浓度的清除率之间具有显著性差异（P＜0.05）；当待测液浓度大于3.13 mg/mL时，其对DPPH自由基清除率的能力趋于平缓，且组间差异不显著（P＜0.05），当质量浓度为 12.50 mg/mL 时，其对DPPH自由基的清除率达到最大（92.95±0.84）%，由图3得出沙葱水提液清除DPPH自由基的IC50值为0.867 mg/mL；TEAC值为51.82 mg Trolox/g，说明每克沙葱干物质对DPPH自由基的抑制功效与51.82 mg Trolox的清除功效相当。本试验所得数据虽然低于人工合成的常用抗氧化剂Trolox，但仍然表现出较高的自由基清除能力。

2.3 沙葱水提液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一组通过延缓糖的消化以降低餐后高血糖状况的口服降糖药，其作用特点是在糖消化的最后一步抑制双糖降解为单糖[16]。沙葱水提液在不同浓度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性如表2所示。

表2 沙葱水提液在不同浓度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 2 The α-glucosidase inhibitory effects of Allium mongolicum Regel aqueous extract in different concentration

沙葱水提液对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的IC50拟合曲线如图4所示。

图4 沙葱水提液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory activity of Allium mongolicum Regel aqueous extract against α-glucosidase

从表2与图4可以看出，沙葱水提液质量浓度在62.50 mg/mL～500.00 mg/mL时，其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率随着质量浓度的增大而增大，说明其在此浓度范围内对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用与提取物浓度有明显的相关性，并且各浓度下的α-葡萄糖苷酶抑制率之间的差异具有显著性（P＜0.05）；当质量浓度为500 mg/mL时，其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到（70.50±1.53）%，抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值为326.29 mg/mL。说明沙葱对α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。

2.4 沙葱对胰脂肪酶的抑制活性

胰脂肪酶是人类消化脂肪的主要酶，应用胰脂肪酶抑制剂可有效抑制胰脂肪酶对脂肪的分解催化作用，达到减少脂肪吸收、控制和治疗肥胖的目的[17]。沙葱水提液在不同浓度下的胰脂肪酶抑制活性如表3所示。

表3 沙葱水提液在不同浓度下的胰脂肪酶抑制活性Table 3 The pancreatic lipase inhibitory effects of Allium mongolicum Regel aqueous extract in different concentration

沙葱水提液对胰脂肪酶活性抑制作用的IC50拟合曲线如图5所示。

从表3可以看出，沙葱水提液对胰脂肪酶活性具有很好的抑制作用，当待测液质量浓度为62.50 mg/mL时，对胰脂肪酶活性的抑制率较低，为（17.70±1.17）%，但随着质量浓度的增大，其抑制活性逐渐增强，4组数据比较具有显著性（P＜0.05）；当质量浓度为500 mg/mL，其对胰脂肪酶活性的抑制率就达到较高的水平，为（90.89±1.82）%，说明其对酶活性的抑制呈现出质量浓度依赖性。由图5的拟合曲线可以得出沙葱水提液胰脂肪酶抑制活性的IC50值为179.41 mg/mL。

图5 沙葱水提液对胰脂肪酶的抑制活性Fig.5 Inhibitory activity of Allium mongolicum Regel aqueous extract on pancreatic lipase

3 讨论

本研究以纯水对脱脂沙葱干粉进行提取，三氯化铝比色法测定得到其总黄酮含量为4.02 mg QE/g DW。此数据结果与萨茹丽等所做的研究结果大致相符[18]。黄酮的基本化学结构是由两个苯环（A环和B环）以杂环吡喃酮环链接的15碳骨架，由于其苯环上的羟基极易失去氢电子，可作为良好的电子供体而发挥抗氧化功能[19]。沙葱待测液对DPPH·清除能力的IC50值为0.883 mg/mL。一般认为如果某种物质的IC50值小于10 mg/mL，那么该物质就具备抗氧化能力[20]。故可初步判定沙葱具有良好的抗氧化能力。

α-葡萄糖苷酶抑制剂可竞争性抑制小肠内各种α-葡萄糖苷酶，减慢淀粉类分解为葡萄糖的速率，可减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后血糖水平的升高，从而减少高血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素敏感性，有效预防并改善糖代谢相关疾病的发生与发展[21]。市面上常见的α-葡萄糖苷酶抑制剂，如已广泛应用于临床的阿卡波糖、伏格列波糖等对餐后高血糖都有较强的调节作用，但长期服用可能会对人体产生一定的副作用[22]。研究表明，多种葱属植物在降糖方面都有功效，如大蒜、洋葱等，在α-葡萄糖苷酶活性抑制方面都有较强的功能[23]。本研究也发现沙葱具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并且随着质量浓度的增高，其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性逐渐增强，这为从天然产物中获取α-葡萄糖苷酶抑制剂提供了新思路。

脂肪是产能系数最高的膳食营养素，而膳食脂肪只有经过胰脂肪酶消化分解才能被人体吸收，对胰脂肪酶抑制活性的测定是评判天然产物作为抗肥胖药物潜在功效中研究最广泛的机制之一[24]。已有研究表明葱属植物中洋葱等在降脂减肥方面具有很好功效[24]。本研究结果显示，当沙葱待测液浓度为500 mg/mL时，对胰脂肪酶活性的抑制率达到90.89%，说明其对胰脂肪酶具有很好的酶抑制作用，鉴于胰脂肪酶活性与肥胖之间的密切联系，沙葱在抑制脂肪分解、降低能量摄入和调节脂代谢等方面可能具有潜在功效。

4 结论

本研究测定得到沙葱水提液中含有较多的黄酮类化合物，自由基清除试验说明沙葱具有良好的体外抗氧化能力，并且其对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用较显著。α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶分别负责体内脂肪和糖类的水解，因此，沙葱作为天然植物来源的α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制剂，具有调节体内糖脂代谢和进一步开发为糖尿病和肥胖的治疗剂或辅助剂的潜力，对其功效成分和生理功能的研究有较好的理论和实践价值。