香蕉皮多酚的提取及其对肉丸贮藏品质的影响

张典，陈金玉，张坤生，任云霞，尚坤，吴鹏

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

贮藏期间的脂肪氧化和蛋白氧化是影响肉及肉制品品质的重要因素，其中脂肪氧化易导致有害物质和腐败臭味的产生[1]，同时氧化产生的系列产物会给贮藏期间肉品的色泽、风味、组织结构以及营养价值带来不利的影响。目前，防止肉制品中脂肪和蛋白质氧化的方法很多，其中添加抗氧化剂是最有效的办法之一。近年来，人工合成抗氧化剂对人体具有不利影响相继被报道[2]，因此，在肉及肉制品中使用天然抗氧化剂成为关注和研究的热点。

植物多酚作为一类广泛存在于植物体内的具有抗氧化活性的天然多酚类化合物，主要存在于植物的皮、根、茎、叶和果中，在自然界的储量非常丰富[3]。我国香蕉产量居世界前列，但其产品主要以鲜品形式销售食用，而占香蕉全果质量40%的香蕉皮等随意丢弃，既浪费资源又污染环境。有研究显示，香蕉皮中不仅含有大量的营养成分，而且含有多种抗氧化活性成分，多酚物质就是其中之一，因而香蕉皮作为天然抗氧化剂的来源具有较大的开发和利用价值[4-5]。目前，关于香蕉皮多酚提取物对肉丸等肉制品贮藏品质的影响尚缺乏研究。

因此，本文在响应面法优化香蕉皮多酚提取工艺的基础上，测定香蕉皮多酚提取物的抗氧化能力，研究不同浓度香蕉皮多酚对肉丸贮藏品质的影响，旨在为香蕉皮的深加工和利用、延缓和降低肉制品贮藏品质劣变，及延长肉制品贮藏期提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香蕉（新鲜、无黑斑）、猪肉、食盐：天津市红桥区华润万家超市西青道店；没食子酸：上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

SHB-Ⅲ型真空循环水泵：巩义市予华仪器有限责任公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；U-5100比例光束分光光度计：日立高新技术公司；A－vanti J-E高效离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；Hunter Lab色差仪：美国Hunter Lab公司；PEN3便携式电子鼻：德国AIRSENSE公司；TA.XT plus物性测试仪：英国Stable Micro Systems公司；AquaLab水分活度测定仪：美国DECAGON公司。

1.2 方法

1.2.1 预处理及香蕉皮多酚的提取

香蕉剥离果肉后将香蕉皮清洗干净，然后将香蕉皮进行切分，称取一定量的香蕉皮在沸水中热烫3min～5 min进行灭酶，之后用一定体积的乙醇水溶液在一定温度下浸提一定时间，利用真空循环水泵滤掉杂质，收集滤液，得到香蕉皮多酚提取液。

1.2.2 香蕉皮中多酚含量的测定

采用福林酚法[6]测定多酚含量，没食子酸作为标准样品。

1.2.3 香蕉皮多酚提取工艺优化

1.2.3.1 单因素试验

香蕉皮多酚在提取过程中，影响提取率的主要因素为乙醇浓度、液料比、浸提时间和浸提温度。分别考察乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、100%）、液料比[1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1（mL/g）]、浸提时间（1、1.5、2、2.5、3.0、3.5 h）和浸提温度（20、35、50、65、80、95 ℃）对香蕉皮多酚提取率的影响。

1.2.3.2 响应面优化试验

根据单因素试验结果，利用Box-behnken设计原理，以多酚得率为响应值，以乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）为变量设计四因素三水平组合试验，因素与水平设计见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Box-Behnken experimental design factors and levels

采用F检验对试验结果进行方差分析以评价模型的统计意义。

1.2.4 香蕉皮多酚抗氧化性能测定

根据响应面试验结果提取得到香蕉皮多酚，将所得多酚进行抗氧化性能测定。

DPPH自由基清除能力测定：取2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液与2 mL不同处理后的蛋白溶液，混匀避光反应30 min后在517 nm处测吸光度值。空白组选用乙醇代替DPPH乙醇溶液；对照组为无水乙醇代替样品与DPPH乙醇溶液反应。计算公式如下：

式中：A1为试验组的吸光度；A2为空白组的吸光度；A3为对照组的吸光度。

还原能力测定：分别取不同处理后的蛋白溶液，加入2.5 mL pH6.6浓度0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液和3.0 mL 1%铁氰化钾溶液，50℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，3 500 r/min离心10 min，取上清3 mL，再加入蒸馏水3 mL混合后加入0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀室温静置15 min，以等量去离子水代替样品溶液调零，在700 nm波长下测定吸光度A[7-8]。

1.2.5 肉丸的制作及香蕉皮多酚的添加

基本配方为80%猪肉、18%蒸馏水（加冰）和2%食盐。将猪肉切成小块后分为四等份，分别作为不添加多酚的对照组（Con）、低浓度（1 mg/mL）香蕉皮多酚组（L）、中浓度（3 mg/mL）香蕉皮多酚组（M）和高浓度（5 mg/mL）香蕉皮多酚组（H），再用绞肉机斩拌搅碎，在斩拌的过程中添加食盐、蒸馏水（加冰）和香蕉皮多酚。将肉糜制成大小相同的肉丸，放到沸水中煮制20 min后进行冷却，放入自封袋中在4℃条件下保存，每3 d测定一次各项指标，即标记时间为0、3、6、9 d。

1.2.6 肉丸指标的测定

1.2.6.1 质构的测定

将待测肉丸切成直径为1 cm厚度大约为1 cm的形状置于测试平台上固定好，室温条件下利用TA-XT Plus型质构仪进行测定。测定模式设置为测前速率1 mm/s；测试速率1 mm/s；测后速率1 mm/s；下压程度为40%；触发类型为自动；引发力5 g；两次压缩之间停留的时间为5 s；数据采集速率为400 Hz；探头型号P/50。每个样品做3组平行。

1.2.6.2 色差的测定

待测肉丸的色差值采用全自动便携式色差计进行测定，在测量色差之前先采用纯白纸或者白色瓷砖校准，记录 L*、a*、b*值，每个肉丸样品测定 3 次，取其平均值。

1.2.6.3 pH值的测定

取不同待测肉丸各5 g，切碎后加50 mL蒸馏水，进行均质，静置5 min，测定pH值，每组进行3次平行试验，取平均值。

1.2.6.4 水分活度的测定

将待测肉丸样品在室温下切碎，铺满样品盒底部，采用水分活度测定仪进行测定，每组进行3次平行试验，取平均值。

1.2.6.5 感官评定

根据GB/T 2210-2008《肉与肉制品感官评定规范》对肉丸进行感官评定，其中10名感官评定员符合GB/T 2210-2008规定的要求。设置1分～10分分别对肉丸的颜色、风味、组织状态、和总体可接受性进行评价打分，取平均值。

1.2.6.6 气味的测定

称取5 g待测肉丸均匀切碎后于烧杯中用保鲜膜密封，常温下贮存30 min后采用便携式电子鼻进行测定，且每种样品检测不低于3次。基本参数设定为：平衡时间600 s；平衡温度40℃；以洁净干燥空气为载气，流速为1 000 mL/min；平衡温度40℃；平衡时间600 s；注射体积 1 000 μL；注射速度 1 000 μL/min；数据采集时间120 s。

1.3 数据处理

通过Design Expert 8.0.6.1软件设计响应面试验，采用软件Excel 2010、Origin8.0对数据进行统计分析并作图，并通过SPSS 16.0对试验数据进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程的建立

根据福林酚比色法得到的多酚含量标准曲线回归方程为：Y=0.084 8X+0.040 1，R2=0.999，其中 Y 为吸光度，X为多酚浓度（mg/L）。

2.2 单因素试验结果与分析

乙醇浓度、液料比、浸提时间、浸提温度对多酚提取率的影响见图1。

图1 乙醇浓度、液料比、浸提时间、浸提温度对多酚提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration，ratio of stuff to liquid，different time and temperature on extraction rate

由图1（a）可知，随乙醇浓度的增大香蕉皮多酚提取率先增大后降低，当浓度为60%时，提取率最大，达到30.71%，浸提效果最佳，原因是乙醇浓度越高，乙醇挥发性越大，对多酚的提取越不利。当液料比由1 ∶1（mL/g）增加到 5 ∶1（mL/g）时，提取率先增加后趋于稳定，这是因为当液料比达到4∶1（mL/g）后溶剂用量趋于饱和，因而继续增大液料比对提取率的影响不显著[9]，考虑到液料比过高会增加浓缩时间和难度[10]，因此最佳液料比为 4 ∶1（mL/g）。由图 1（b）可以看出，随浸提时间的延长，提取率先上升后下降，当时间为2.0 h时提取率达到最大，出现上述趋势的原因与香蕉皮多酚的不稳定性有关，浸提时间越来对多酚的破坏越显著。随浸提温度的升高，提取率呈先上升后降低的趋势，当浸提温度为80℃时，多酚提取率最高，这是由于温度升高，分子运动加速，氢键更易断裂，多酚的渗透、溶解、扩散速度也加快，因而酚类物质更容易从原料中溶出，多酚提取率增大[9]，而当温度过高时，多酚类物质容易发生氧化或降解反应，因而提取率降低。

2.3 响应面优化结果与分析

根据单因素试验结果，设计四因素三水平响应面试验，以多酚提取率作为响应值，利用Design-Expert 8.0.6.1软件进行多元回归拟合。得二次多项式拟合方程为：Y=44.361 16+1.028 6A－0.363 78B+2.989 608C－2.499 36D －1.999 83AB －0.230 78AC －0.265 35AD+2.107 328BC+1.857 35BD+3.508 275CD －3.800 4A2－3.008 28B2－3.820 34C2－2.560 89D2。

回归模型的显著性检验和方差分析见表2。

表2 回归模型方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

由表2可知，该模型的F值为2.739，P＜0.05表明模型显著。失拟项的F值为3.298，P=0.130 7＞0.05，故失拟项不显著，说明模型选择合适，该模型与实际情况拟合良好，可由此预测香蕉皮多酚提取的最佳条件。方差分析表明，浸提温度和浸提时间对多酚提取率的影响显著，从各变量显著性检验P值的大小可以看出影响香蕉皮多酚提取率的各因素按大小排序依次为：浸提温度＞浸提时间＞乙醇浓度＞液料比。乙醇浓度平方项、液料比平方项、浸提温度平方项对多酚提取率的影响显著。

2.4 验证试验结果

根据Box-Behnken试验所得出的结果以及二次多项式回归方程，再利用Design-Expert 8.0软件获得了磷酸化条件的最佳因素组合：乙醇浓度62.4%、液料比 3.68 ∶1（mL/g）、提取温度 80.29 ℃、提取时间 1.7 h，此时预测的香蕉皮多酚提取率为45.33%。为检验模型预测的准确性，在此条件下进行3组平行验证试验，得到的香蕉皮多酚提取率为44.63%，显然误差值在±1%以内。由此可见，采用响应面法优化香蕉皮多酚提取工艺是行之有效的。

2.5 香蕉皮多酚抗氧化性分析

不同浓度香蕉皮多酚的抗氧化能力见图2。

图2 不同浓度香蕉皮多酚的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of different concentrations of banana skin polyphenols

多酚是一类活性较强的抗氧化物质，具有供氢能力因而可有效清除自由基，同时还可与过氧化自由基结合使其成为稳定的化合物，另外多酚还可以通过抑制氧化酶和络合金属离子等起到抗氧化作用[11]。本试验研究了不同浓度的香蕉皮多酚对DPPH自由基清除能力和还原能力的影响。从图2中可以看出，随着香蕉皮多酚浓度的增大，DPPH自由基清除能力和还原能力均呈近似直线递增，即抗氧化能力逐渐增强。有研究表明[9]，香蕉皮提取液中确认并检测到的多酚达11种，且香蕉皮多酚的还原能力强于维生素C、叔丁基对苯二酚，还原能力随浓度的增加而增强，这与本试验测定的结果一致。

2.6 香蕉皮多酚对肉丸质构的影响

不同浓度香蕉皮多酚对肉丸质构的影响见图3。

图3 不同浓度香蕉皮多酚对肉丸质构的影响Fig.3 Effects of different concentrations of banana skin polyphenols on the texture of meatballs

不同处理肉丸的硬度变化如图3（a）所示，硬度随贮藏时间的延长大体呈现上升的趋势。在第0天时，添加不同浓度的香蕉皮多酚均使肉丸的初始硬度下降，且差异显著（P＜0.05）。这可能是由于香蕉皮多酚在一定程度上破坏了肉丸中的蛋白质聚合及交联结构，引起了硬度的降低[12]。从图中可看出，添加香蕉皮多酚虽能有效改善肉丸的初始硬度，但不能延缓肉丸硬度的增加。特别是添加低浓度香蕉皮多酚的肉丸其硬度值显著高于对照组，而中高浓度与对照组相比差异不大，这可能是由于中高浓度时有多余的酚类物质可以形成超氧自由基和过氧化合物从而促进脂肪氧化，使肉丸硬度的增加幅度相比低浓度减小[13]。

由图3（b）可见，肉丸的弹性呈现出相对稳定的结果。在整个贮藏期间，不同香蕉皮多酚添加量与对照组相比大体一致，没有显著性差异（P＜0.05）。对比不同香蕉皮多酚浓度对肉丸弹性的影响，发现添加低浓度香蕉皮多酚的肉丸弹性一直高于其他处理组及对照组。

2.7 香蕉皮多酚对肉丸色差的影响

不同浓度香蕉皮多酚对肉丸色差的影响见表3。

表3 不同浓度香蕉皮多酚对肉丸色差的影响Table 3 Effect of different concentration of banana skin polyphenols on the color difference of meatballs

颜色是肉制品重要品质之一，是影响消费者购买的主要因素。L*表示肉丸表面的亮度值，a*表示绿红值（a*为负值时指示绿色，为正值时指示红色），b*表示蓝黄值（b*为负值时指示蓝色，为正值时指示黄色），其中a*主要取决于肉中肌红蛋白的数量和氧化程度[13]。表3为添加不同浓度香蕉皮多酚的肉丸贮藏期间的颜色（L*、a*和b*）变化情况，添加了香蕉皮多酚的肉丸与对照组相比，初始L*、a*和b*值均发生了不同程度的变化。其中，添加香蕉皮多酚的肉丸L*初始值显著高于对照组，a*和b*初始值显著低于对照组。这可能是由于提取得到的香蕉皮多酚本身所具有的黄褐色导致L*增大。随着贮藏时间的增加，a*值呈下降的趋势，这可能是由于肌红蛋白被氧化为高铁肌红蛋白[14]。由表中可以看出，在贮藏期间香蕉皮多酚添加组的a*值变化幅度均小于对照组，说明香蕉皮多酚可以抑制肌红蛋白的氧化，防止肉丸a*值的下降。香蕉皮多酚由于具有抗氧化活性，可以与肉丸中氧合肌红蛋白竞争脂质过氧化基，阻止肌红蛋白氧化，从而减缓贮藏期间肉丸的a*值下降速度[15]。

2.8 香蕉皮多酚对肉丸pH值的影响

肉丸在蒸煮过程由于温度升高，肉中不同蛋白质变性从而引起蛋白表面酸碱基团发生动态变化，导致猪肉丸pH值升高[16]，因此，本试验测得的熟制肉丸pH值比鲜肉本身的pH值略高。不同浓度香蕉皮多酚对肉丸pH值的影响见图4。

图4 不同浓度香蕉皮多酚对肉丸pH值的影响Fig.4 Effects of different concentrations of banana skin polyphenols on the pH value of meatballs

由图4可知，添加不同浓度的香蕉皮多酚后肉丸的初始pH值均呈显著下降（P＜0.05），这可能是因为香蕉皮多酚提取物本身呈弱酸性，在一定程度上降低了肉丸的pH值。在肉丸贮藏期间，随贮藏时间的延长，不同添加组肉丸的pH值在贮藏前期有略微上升，而在贮藏后期呈不同程度的下降，这是由于在前期肉丸中的物理化学变化造成蛋白质降解，产生胺类物质，使pH值略微上升，而在贮藏后期由于微生物发酵产酸，使pH值降低。整个贮藏期间，添加了香蕉皮多酚的肉丸与对照组相比，pH值的改变幅度并不显著。这是由于在肉丸的贮藏期间香蕉皮多酚发挥了抑菌作用，防止了肉丸的腐败变质。有研究表明，植物中的多酚组分能有效抑制食源性病原菌的生长繁殖，并且它们的抑菌活性与多酚含量密切相关[17-18]。在本试验中，低浓度香蕉皮多酚的添加对肉丸pH值改变的抑制作用更加明显。而多酚组分之所以具有抗菌活性，是因为它们能够降解细菌细胞壁，扰乱细胞的胞浆膜，从而引起细胞组分的泄露，还能改变细菌细胞的脂肪酸和磷脂组分，影响DNA和RNA的合成以及破坏蛋白的易位等[19]。

2.9 香蕉皮多酚对肉丸水分活度的影响

水分活度表明的是食品内在的性质，与食品的组成结构有关[20]。有研究表明，水分活度与食品的保鲜质量关系密切，食品中的水活性可以影响食品中细菌、霉菌以及其他微生物的生长，与腐败变质之间有着直接的关系[21-22]，因此降低食品的水活度可以延长食品的货架期。不同浓度香蕉皮多酚对肉丸水分活度的影响见图5。

图5 不同浓度香蕉皮多酚对肉丸水分活度的影响Fig.5 Effects of different concentrations of banana skin polyphenols on the water activity of meatballs

从图5可知，整体而言多酚添加组与对照组水分活度数值基本维持在1.0附近。虽添加香蕉皮多酚对肉丸水分活度的影响不大，但仍可看出中高浓度香蕉皮多酚的添加使肉丸初始水分活度显著下降（P＜0.05），说明中高浓度香蕉皮多酚的添加对贮藏品质变化有减缓作用；而随着贮藏期的延长，水分活度逐渐上升，这是由于在贮藏的过程中，pH值降低导致肉中蛋白质持水能力下降，游离出大量的自由水，从而提高了水分活度[23]。

2.10 香蕉皮多酚对肉丸感官指标的影响

不同添加组的感官评定指标在贮藏期的评分如表4所示。

表4 不同浓度香蕉皮多酚对肉丸感官指标的影响Table 4 Effect of different concentration of banana skin polyphenols on the sensory indicators of meatballs

续表4 不同浓度香蕉皮多酚对肉丸感官指标的影响Continue table 4 Effect of different concentration of banana skin polyphenols on the sensory indicators of meatballs

与对照组相比，多酚添加组由于添加香蕉皮多酚，对肉丸的初始色泽造成一定影响，颜色评分略有下降，但随着贮藏天数的增加，对照组的颜色暗淡变化更显著，评分下降明显，而多酚添加组颜色相对更亮，评分下降缓慢，这与本试验的色差数据吻合度良好。肉丸的初始风味和组织状态受香蕉皮多酚的影响并不显著，两者变化趋势类似。整体来看，随着贮藏天数的增加，感官指标均有不同程度的下降，但添加香蕉皮多酚的肉丸，在贮藏期的感官评分下降程度均有所减缓，即多酚的添加使肉丸劣变延缓，且中高浓度的添加对肉丸感官评分的延缓影响更显著。

2.11 香蕉皮多酚对肉丸气味的影响

添加不同浓度香蕉皮多酚的肉丸在贮藏期间电子鼻分析见图6。

图6 不同浓度香蕉皮多酚对第0、3、6、9天肉丸的电子鼻分析Fig.6 Electron nose analysis of meatballs on 0，3，6，9 d

如图所示，第一主成分和第二主成分的贡献率在不同时间有所差异，两者累计贡献率在第0天、第3天、第6天和第9天分别为90.11%、66.05%、82.39%和71.75%。随着贮藏天数的增加，不同处理组的散点开始出现部分重合，说明它们的气味比较相近，在贮藏期间产生了相近的气味物质。从分布区域看，添加香蕉皮多酚的肉丸在第6天时其第一主成分相近，第二主成分跨度较大，但是第二主成分的贡献率较低，所以三者气味相对较接近，但仍能够通过第二主成分进行区分。同时发现贮藏过程中，各样品组间的气味发生了不同程度的变化，各样品点分布分散，通过第一主成分分析能够很好的区分对照组与处理组的样品间的气味关系，同时对照组样品在贮藏期间的第一主成分和第二主成分分布区域变化较大，而香蕉皮多酚添加的肉丸虽也能够通过主成分进行较好的区分，但相比对照组其主成分分布区域相近，这说明添加香蕉皮多酚能够延缓肉丸在贮藏期间由于氧化导致的气味变化。

3 结论

通过响应面优化试验得到香蕉皮多酚提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度60%、液料比3.68∶1（mL/g）、浸提温度80℃、浸提时间1.5 h，在此条件下得到的香蕉皮多酚具有显著的抗氧化活性。香蕉皮多酚对肉丸贮藏品质的影响结果表明，随着贮藏时间的延长，添加香蕉皮多酚的肉丸硬度增加没有减缓，但能有效改善肉丸的初始硬度、然而弹性变化不显著；香蕉皮多酚添加组的a*值变化幅度小于对照组；肉丸pH值的改变幅度小于对照组；香蕉皮多酚的添加对肉丸水分活度的影响不显著，但中高浓度的添加能显著降低初始水分活度；多酚添加组的肉丸感官指标评分下降幅度显著减缓；贮藏期间多酚添加组肉丸氧化产生的刺激性气味得到抑制。由此可见，香蕉皮多酚可以改善肉丸的贮藏品质，延长肉制品的贮藏期。