葛根醇提物对糖尿病肾病小鼠肾功能改善的研究

龚频，田东，王丹妮，杨文娟

（陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021）

葛根在传统中医药理论中常用作生津止渴、解肌退热药，《圣惠方》中有记载，“葛粉四两，先以水浸粟米半升，一夜漉出，拌匀，煮粥食之，可去烦躁消热渴”，而且葛根分布广泛、易种植、生物产量高[1]，所以，自古以来葛根都以典型的药食两用性豆科植物而存在。葛根的活性成分主要分为葛根黄酮和葛根多糖两大类，葛根异黄酮不仅具有抗氧化应激、调节血糖、延缓衰老、预防心脑血管疾病等生物活性[2-3]，也有研究表明，葛根素在抗炎、抗痛风[4]、抗肿瘤[5]、神经保护[6]、预防骨质疏松[7]等方面展现出很强的药理活性，而葛根多糖则在清除自由基、提高免疫力以及抑菌等方面表现出较好的生物活性[8]。作为药食同源性植物，葛根不仅毒副作用小，且具有较高的药用价值、广阔食品前景、丰富生物来源等特点，使其作为特殊性膳食食品开发具有很大的发展空间。

糖尿病是一种糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的慢性疾病，随着人们饮食结构和生活习惯不断改变，加上快节奏生活所带来的各方面压力，导致糖尿病的发病率逐年上升。糖尿病所引起的机体代谢活动失调在损伤不同组织细胞的同时诱发多种并发症，其中以糖尿病肾病最为常见，其发病率也逐年升高[5]。糖尿病对肾功能的损害主要表现在糖脂代谢紊乱导致肾小球血管袢的微血管病变，毛细血管通透性增强；氧化应激损伤正常细胞，滤过屏障受损；炎症细胞浸润，肾小管重吸收减弱，致使正常肾功能受损[10]。

本次研究以乙醇提取物的形式结合葛根黄酮和葛根多糖的多种生物活性，旨在以动物实验构建糖尿病肾病小鼠模型后喂食葛根提取物，取样检测并分析实验数据，研究葛根醇提物对糖尿病肾病小鼠的保护作用，进而证明葛根的乙醇提取物在特殊膳食食品添加中的广阔前景，为开发具有肾保护功能的特殊膳食食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验动物与试剂

SPF级雄性昆明小鼠30只，购买于西安交通大学实验动物中心（许可证号：SCXK（陕）2017-003）；葛根：西安市同仁堂大药房；氯化镉（CdCl2）：分析纯，天津市福晨化学试剂厂；0.9%生理盐水：河北天城药业股份有限公司；肝素钠：高纯，西安热默尔生物技术有限公司；甲醛、乙醇：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；固体石蜡：熔点：52℃～59℃，上海华灵康复器械厂；苏木精：高纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；署红：分析纯，天津市博迪化工有限公司；肌酐（creatinine，CRE）试剂盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）试剂盒、乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-acetylβ-glucosaminidase，NAG）试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 仪器

罗氏血糖仪、罗氏血糖试纸：活力型，德国罗氏公司；varioskan flash全波长多功能扫面读数仪：赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根的提取及给药剂量

本次实验以60%乙醇为溶液、30℃下超声提取葛根[11]，然后将所得浸膏的水溶液给予模型鼠给药。

结合课题组前期造模经验，CdCl2的给药剂量定为每天1 mg/kg[12]，根据提取物出膏率结合2015版《中国药典》中葛根的安全用药范围，葛根乙醇提取物的给药剂量确定为每天400 mg/kg。

1.2.2 动物分组及模型构建

30只雄性小鼠，18 g～22 g，自由饮水进食适应性饲养3 d，随机分为3组，即空白组、模型组和保护组，每组10只。空白组10只小鼠普通饲料喂养并且每天注射生理盐水0.01 mL/g；其余20只小鼠高脂高糖饲料喂养，每天注射CdCl2溶液0.01 mL/g（给药量1 mg/kg），持续喂养60 d。空白组小鼠数量不变，注射CdCl2的小鼠随机分为模型组和给药组，每组10只[12]。第61天开始，保持之前的饲养方式不变的前提下，空白组和模型组小鼠灌胃生理盐水0.01 mL/g；按0.01mL/g的给药体积（给药量400 mg/kg）灌胃给予保护组小鼠葛根的60%乙醇提取物的水溶液，继续喂养30 d。于第31天下午进水禁食，12 h后测空腹血糖值，并取血清样品于-80℃保存备用，取肾脏样品于福尔马林溶液（4%甲醛）中保存备用[13]。

1.2.3 生理指标分析

建模期间观察小鼠的毛色、生活习性和精神状态等体征变化，并每天记录小鼠的体重差异。建模结束前一天禁食不禁水12 h后，小鼠断尾取血测定空腹血糖值。

1.2.4 生化指标检测

禁食但进水12 h后，注射1%肝素钠，于眼底动脉取血冰浴中静置5 min，3 000 r/min离心10 min，取血清样品于-80℃保存备用。按试剂盒所示方法测定血清中的肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）、乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）。

1.2.5 形态学分析

解剖小鼠后取出肾脏去掉薄膜并除去腹腔液后称重，浸泡于福尔马林溶液中于室温中保存备用。固定一周后取少量组织块乙醇脱水处理后用石蜡包埋，切片5 μm厚度，脱蜡处理后用苏木精和署红染液依次染色，并于光学显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 生理指标结果

不同组小鼠体重、空腹血糖值变化见图1。

图1 不同组小鼠体重、空腹血糖值变化图Fig.1 Changes in body weight and fasting blood glucose levels in different groups of mice

如图1A所示，与空白组相比，模型组和保护组小鼠都给予腹腔注射CdCl2，致使饲养的前11周，小鼠体重短暂上升后持续下降且精神萎靡毛色暗黄，15周后由于持续损伤导致模型组小鼠出现严重的腹部积水，体重反弹。11周后，保护组小鼠开始给予灌胃葛根的60%乙醇提取物的水溶液，所以，与模型组相比，保护组小鼠从12周开始体重慢慢回升。从生长状况可以发现葛根提取物能够有效缓解CdCl2联合高脂高糖饲料对小鼠造成的机体损伤，维持其正常的生活状态，可能与葛根提取物对部分脏器形成保护作用相关。

如图1B图所示，对小鼠12 h空腹血糖值分析发现，与空白组的正常小鼠相比，模型组小鼠空腹血糖值上升明显（P<0.001）。灌胃给予葛根提取物一段时间后，发现与模型组相比，给药保护组小鼠的空腹血糖值明显有所下降，且具有统计学意义（P<0.05）。有研究表明葛根降糖降脂作用可能与其主要活性成分葛根多糖能够清除体内自由基含量，维持机体氧化应激相关酶系活性正常的活性相关[14]。也有研究显示葛根素的降糖活性可能由于其能够增加G6PD的活性、降低MIN6细胞的氧化应激水平，起到保护线粒体、促进MIN6细胞存活的作用[15]。葛根提取物的血糖调节作用可能是葛根素、葛根多糖以及葛根总黄酮的有效成分协同调节的结果，较好的发挥多组分少剂量联合作用的优势，这样也可以避免单一组分因剂量问题引发的毒副作用，而更好的发挥其生物活性。

2.2 生活指标结果

不同组小鼠CRE、BUN和NAG含量见图2。

图2 不同组小鼠CRE、BUN和NAG含量Fig.2 CRE，BUN and NAG content in different groups of mice

如图2A所示，对肾功能评价指标考察分析，发现模型组与空白组相比，模型组小鼠血清中肌酐含量明显较高，且具有统计学意义（P＜0.001）。但与模型组相比，保护组小鼠肌酐含量显著降低（P＜0.001）。如2B图，分析尿素氮（BUN）数据发现，与空白组小鼠相比，模型组小鼠血清中尿素氮（BUN）含量明显升高（P＜0.001）；但保护组在灌胃一段时间葛根提取物后，与模型组小鼠相比，血清中尿素氮（BUN）含量则明显降低，接近空白组小鼠（P＜0.01）。如图2C显示，模型组与空白组相比，小鼠血清中乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性明显上升，且数据具有统计学意义（P＜0.001）；但相比模型组，保护药组小鼠血清中乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性则有所降低，数据也具有统计学意义（P＜0.01）。

相关研究表明，TGFβ-Smad信号通路异常是引发糖尿病诸多并发症及肾功能损伤形成的关键因素，而葛根异黄酮可以通过调节糖尿病肾病患者的细胞内TGFβ-Smad通路，防止血液流变学异常，发挥维持肾功能正常的效果[16]。也有研究发现，葛根对肾脏的保护作用与其主要活性成分葛根素减弱SIRT1-FOXO1通路、下调相关活性蛋白密切相关[17]。

2.3 形态学实验结果

光镜下小鼠肾脏组织切片见图3。

图3 光镜下小鼠肾脏组织切片图（HE×400）Fig.3 Photomicrograph of mice kidney tissue under light microscope（HE×400）

肾脏组织的HE染色切片图在400倍光学显微镜下观察，可以清楚地看到空白组小鼠肾组织结构正常，肾小球的球形结构饱满，细胞核分布均匀，排列整齐，未见病理改变；模型组小鼠，肾脏组织结构排列混乱，肾小球皱缩，细胞核重叠，基本的球形结构消失，肾间质水肿明显，并伴有炎症细胞浸润，出现明显的病变特征；与模型组相比，保护组小鼠肾脏上述病变情况有所减轻，整体排列整齐，可见肾小球球形结构完整，肾间质可见轻微水肿和炎性细胞浸润。

3 结论

本研究发现，对糖尿病肾病小鼠灌胃一定量葛根提取物后，受试小鼠体重、血糖等生理指标得到明显改观，肾功能评价指标CRE、BUN、NAG等也较正常小鼠有所变化。表明适量的葛根提取物可以缓解糖尿病肾病小鼠的病情恶化，能够有效减缓糖尿病肾病早期时氧化应激、微血管病变等多种因素对肾功能的损害，为适用于糖尿病肾功能障碍群体的特殊膳食食品的开发提供可选的理论依据。