酶解褐藻寡糖的分离制备及其脂蛋白调节作用

陈岩君，窦文芳，李恒，史劲松，许正宏

1(江南大学 药学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡,214122) 2(江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡,214122) 3(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡,214122)

在正常情况下，人体主要通过肝脏对胆固醇进行摄取，使血液中的胆固醇含量维持在正常范围之内。在肝脏摄取胆固醇的过程中，低密度脂蛋白受体(low-density-lipoproteinreceptor，LDLR)起主要作用。低密度脂蛋白(low-density-lipoprotein，LDL)是一种运载胆固醇进入组织细胞的脂蛋白颗粒。LDLR是一种膜镶嵌式蛋白质，能够摄取血浆中的LDL-胆固醇从而降低其在血浆中的含量，在脂蛋白代谢中起关键作用[1-2]。

近年来，蛋白转化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，PCSK9)被发现是血浆LDL-胆固醇水平的关键调节剂[3]。PCSK9是哺乳动物前蛋白转化酶家族的可溶性丝氨酸蛋白酶[4]，主要由肝脏合成、分泌，在其他组织如肾脏、小肠、中枢神经系统、胰腺、结肠上皮和血管平滑肌细胞有较少的分泌[5-7]。PCSK9分泌到血液中，通过细胞内和细胞外2个独立的方式与LDLR的表皮生长因子样重复A(EGF-A)结构域结合，诱导LDLR进入溶酶体降解。当血浆PCSK9水平升高时，肝细胞表面LDLR降解，影响血液中LDL-胆固醇的清除而导致LDL-胆固醇水平升高；当PCSK9含量降低时，LDLR的水平升高，可以转化更多的LDL-胆固醇[8-9]。因此，PCSK9被认为是预防和治疗高胆固醇血症和心血管疾病的重要靶标。

褐藻胶是一种由海洋褐藻生成的阴离子多糖，是由(1→4)连接的D-甘露糖醛酸(mannuronicacid，M)和其C5异构体L-古洛糖醛酸(guluronicacid，G)组成的线性聚合物，以均聚(MM或GG)或异聚(MG或GM)方式排列组成。主要存在3种结构片段：β-D- (1，4)连接的聚甘露糖醛酸片段(Polymannuronate，PM)，α-L-(1，4)连接的聚古洛糖醛酸片段(polyguluronate，PG)，G与M交替共聚的片段PMG[10-13]。褐藻寡糖可以通过酶解法或物理化学法降解褐藻胶制备。与化学和物理方法相比，酶解法具有高产量、污染小、可生成特定寡糖的优点。研究显示，褐藻寡糖能够增加低密度脂蛋白的摄取，可开发成新一代降胆固醇药物。但生物降解获得的褐藻寡糖是聚合度不一的寡糖混合物，糖基组成和寡糖活性存在较大差异，严重影响了批次稳定性及产品品质，限制了其推广应用。该文采用IsoptericolahalotoleransCGMCC5336褐藻胶裂解酶制备褐藻寡糖，经分离、纯化后得到聚合度均一的寡糖，并研究了不同聚合度寡糖对HepG2细胞LDLR和PCSK9蛋白水平的影响，以期为后续应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜盐白蚁菌(Isoptericolahalotolerans) CGMCC 5336，本实验室筛选并保藏的菌株。人肝癌细胞(HepG2)，购自中科院上海细胞库。

1.2 主要仪器

Bio Gel P2(fine,45-90μm)，美国Bio-Rad公司；机械搅拌玻璃发酵罐Biotech-5JG(5 L)，上海保兴生物设备工程有限公司；荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；蛋白电泳装置，美国Bio-Rad公司；多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不饱和褐藻寡糖的制备

将嗜盐白蚁菌CGMCC 5336接种于种子培养基，25 ℃、120 r/min培养24 h。按1%接种量(40 mL)接入罐上发酵培养基中培养48 h，8 000 r/min离心10 min去除菌体，用超滤法浓缩酶液，通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定酶的活性。1个酶活力单位(U)被定义为:1 min产生1 μg还原糖所需的褐藻胶裂解酶的量。将海藻酸钠(12 g)溶解于1 L的50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，加入52 200 U褐藻胶裂解酶，40 ℃反应4 h，加水煮沸15 min停止酶反应。8 000 r/min离心5 min除酶。根据大分子多糖和蛋白质不溶于乙醇的特点，通过在酶解液中加入乙醇使其沉淀。将酶解液浓缩至约100 mL，加入无水乙醇至乙醇终浓度为60%，4 ℃沉淀过夜。收集上清液，浓缩并冻干，得到褐藻粗寡糖。

1.3.2 液相条件

色谱仪：WATERS ACQUITY UPLC；分析柱：BEH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流动相：A乙腈，B 0.1% 甲酸(A 2%，B 98%，0 min；A 10%，B 90%,8 min)；流速：0.3 mL/min；柱温：45 ℃；进样量：5 μL。

1.3.3 质谱条件

离子方式: ESI；毛细管电压: 3.0 k；锥孔电压: 20 V；离子源温度: 100 ℃；脱溶剂气温度: 400 ℃；碰撞能量：6/20 Volts；质量范围(m/z): 20～1 000；Detector电压: 1 800 V。使用MassLynx 4.1对样品数据进行分析和处理。

1.3.4 Bio-Gel P-2凝胶层析法分离寡糖

称取褐藻粗寡糖150 mg，溶于1 mL 1 mol/L NaCl溶液中，用0.22 μm水膜过滤样品，使用150 cm×1.0 cm Bio-Gel P-2凝胶柱进行分离，流动相为2.5 mmol/L Tris-1 mol/L NaCl溶液，流速为0.1 mL/min。于室温下进行分离，使用半自动收集器收集样品，每15 min收集1管。在230 nm测量吸光度值。将收集到的相同组分进行合并。

1.3.5 MTT测定

(1)

1.3.6 荧光定量PCR

根据制造商的说明书使用Trizol提取总RNA。将RNA稀释至40 ng/mL后，加入引物、模板对其进行反转录，PCR条件为：25 ℃，10 min；48 ℃，40 min；95 ℃，5 min；12 ℃，∞。反转录总RNA以获得cDNA。使用SYBR green premix进行qRT-PCR，条件为50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，45个循环扩增。使用下列引物序列：人LDLR，5′-TTGGCTGCGTTAATGTGA-3′(有义)和5′-TGATGGGTTCATCTGACCAGT-3′(反义);人SREBP-2，5′-CAGTGGGACCATTCTGAC-3′(正义)和5′-TTCCTCAGAACGCCAGACTT-3′(反义);人PCSK9，5′-GCTGAGCTGCTCCAGTTTCT-3′(有义)和5′-AATGGCGTAGACACCCTCAC-3′(反义)：以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt对基因的表达水平进行相对定量。

1.3.7 蛋白免疫印迹分析

在6孔板中加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上静置30 min后收集蛋白，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。配制10%分离胶和浓缩胶，每孔蛋白含量为30 μg，80 V条件下使蛋白样品电泳至分离胶与浓缩胶之间时，调节电压至100 V，样品中的溴纷蓝跑至电泳槽底时即可停止电泳。

将胶取出，与聚偏氟乙烯膜(PVDF)、滤纸、海绵组成三明治结构，放入转膜缓冲液中转膜，然后将转膜仪置于冰水浴中，100 V恒流转膜100 min。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h后，用TBST洗涤3遍，与一抗4 ℃孵育过夜，用TBST洗涤3遍，再与辣根过氧化物酶(HRP)-二抗孵育1 h后，用TBST溶液洗涤3遍，加入ECL化学底物发光试剂，凝胶成像仪检测目的蛋白条带，利用Image J软件计算条带灰度，以GAPDH作为对照。

2 结果与分析

2.1 褐藻寡糖的制备

采用褐藻胶裂解酶对海藻酸钠进行酶解，得到褐藻粗寡糖命名为FrA。

2.2 LC-MS分析

通过LC-MS对FrA进行分析。其液相分析图如图1所示，主要观察到5个峰，其出峰时间分别为0.65、3.14、3.73、4.46、5.46 min。分别对5个峰进行质谱分析，峰1结果如图2-a所示，确定该峰为杂质峰。峰2的质谱分析如图2-b所示，其中质荷比数351、703均可与寡糖的分子量相对应，故可能为二糖或四糖。峰3的质谱分析如图2-c所示，其中质荷比数527、1055均可与寡糖的分子量相对应，故可能为三糖或六糖。峰4的质谱分析如图2-d所示，其中质荷比数只有703与寡糖分子量相对应，确定其为四糖。峰5的质谱分析如图2-e所示，确定其为四糖。则峰2为二糖，峰3为三糖，其所对应的质谱图分别为二、三糖的质谱图。二糖质谱图中的703和三糖质谱图中的1055可能是两个糖分子连在一起，即[2M-1]。

图1 褐藻粗寡糖的液相图谱Fig.1 The LC analysis of alginate oligosaccharides

图2 褐藻粗寡糖的质谱图Fig.2 The MS analysis of alginate oligosaccharides

2.3 凝胶色谱分离

通过Bio-Gel P2凝胶柱对制备得到的褐藻粗寡糖进行分离。使用0.25 mol/L Tris-1 mol/L NaCl缓冲液进行洗脱，上样量为1 mL，样品质量浓度为150 mg/mL，流速为0.1 mL/min，通过使用半自动部分收集器对洗脱液进行收集，每管1.5 mL。使用230 nm处的吸收值绘制分离曲线。结果如图3所示，共得到4个组分，分别标记为Fr1，Fr2，Fr3和Fr4，Fr1中可能含有不同聚合度的寡糖。Fr2-4这3个组分分离度较好，可能为聚合度均一的寡糖。此外Fr1-Fr4分子量依次减小，Fr4的分子量最小。

图3 Bio-Gel P2洗脱曲线Fig.3 The isolation eluted of Bio-Gel P2

2.4 LC-MS分析

Fr1的液相图如图4所示，共含有2个峰，分别为峰1和峰2。在峰1的质谱图中，如图5-a，质荷比879可以与聚合度为5的褐藻寡糖的分子量相对应，因此Fr1液相图中峰1是五糖；峰2质谱图，如图5-b，质荷比1065、879、527分别对应于聚合度为6、5、4的褐藻寡糖，由于峰2的分子量较峰1大，故确定Fr1中峰2为六糖。

图4 Fr1的液相图谱Fig.4 The LC analysis of Fr1

图5 Fr1的质谱图Fig.5 The MS analysis of Fr1

在Fr2-Fr4的液相图中，如图6所示，均只含有1个液相峰。与FrA的液相图谱相比较，Fr2的液相图如图6-a，其液相峰保留时间为4.37 min，确定为四糖；Fr3的液相图如图6-b 所示，其液相峰保留时间为3.61 min，确定为三糖；Fr4的液相图如图6-c所示，其液相峰保留时间为3.12 min，确定为二糖。

图6 Fr1的质谱图Fig.6 The MS analysis of Fr1

2.5 不同质量浓度的4种组分对HepG2细胞活性的影响

通过MTT实验测定不同质量浓度的Fr1-Fr4(0.062 5-1 mg/mL)对HepG2细胞活性的影响。结果如图7所示。

图7 Fr1-Fr4对HepG2细胞存活率的影响Fig.7 Cell viability of HepG2 cells exposed with Fr1-Fr4

当用不同质量浓度的4种组分刺激HepG2细胞12 h后，细胞存活率均在80%以上，表明Fr1-Fr4在1 mg/mL以下，对HepG2细胞的毒性较低。

2.6 四种组分对HepG2细胞LDLR基因及蛋白表达的影响

用1 mg/mL的Fr1-Fr4及FrA刺激细胞12 h，通过qRT-PCR检测4种组分对HepG2细胞LDLR基因表达的影响。结果如图8所示，Fr4能够显著上调LDLR的转录水平。

图8 Fr1-Fr4对HepG2 LDLR基因表达的影响Fig.8 Effects of Fr1-Fr4 on the gene expression of LDLR 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

通过Western Blot检测4种组分对HepG2细胞LDLR蛋白表达的影响。实验结果如图9所示，Fr1、Fr3和Fr4均能显著上调LDLR的蛋白表达水平，其中Fr4的调节作用最为显著。LDLR的增加有利于肝细胞对血浆中LDL-胆固醇的摄取，从而降低血浆胆固醇水平。其中Fr4对LDLR蛋白表达水平的上调作用可能与其对LDLR转录水平的上调作用有关。而其他组分对LDLR的调节作用主要受其他因素的影响。

图9 Fr1-Fr4对HepG2细胞LDLR蛋白表达的影响Fig.9 Effect of Fr1-Fr4 on the protein expression of LDLR 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

2.7 四种组分对HepG2细胞PCSK9蛋白表达的影响

通过Western Blot检测4种组分对HepG2细胞PCSK9蛋白表达的影响，用1 mg/mL的Fr1-Fr4及FrA刺激细胞12 h。结果如图10 所示，Fr3对PCSK9蛋白表达水平有明显下调作用，Fr1和Fr2具有上调作用。Fr4对其调节作用不明显。PCSK9增多，会造成LDLR的降解。当PCSK9被抑制时，LDLR蛋白含量增加。所以，Fr3对LDLR蛋白水平的上调作用可能与其对PCSK9的抑制作用有关。

图10 Fr1-Fr4对HepG2细胞PCSK9蛋白表达的影响Fig.10 Effect of Fr1-Fr4 on the protein expression of PCSK9 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

2.8 Fr4对HepG2细胞SREBP-2基因表达的影响

LDLR基因表达主要受固醇反应原件结合蛋白-2(SREBP-2)的调控，而Fr4对LDLR转录水平有明显的上调作用。通过qRT-PCR考察Fr4对SREBP-2转录水平的调控作用。结果如图11 所示，Fr4能够显著上调SREBP-2转录水平。这表明，Fr4对LDLR转录水平的上调作用可能与其对SREBP-2的激活作用有关。

图11 Fr4对SREBP-2基因表达的影响Fig.11 Effects of Fr4 on the gene expression of SREBP-2 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

3 结论

通过Bio-Gel P2凝胶柱对酶解产生的褐藻粗寡糖进行分离纯化，得到聚合度均一的寡糖。在分离得到的4个组分中Fr1，Fr3，Fr4均能上调LDLR蛋白水平，其中Fr3和Fr4的活性更显著。Fr4能够上调LDLR转录水平，Fr3能下调PCSK9的蛋白水平，这表明Fr4对LDLR蛋白水平的调节作用受LDLR转录水平的影响；Fr3对LDLR蛋白水平的上调作用与PCSK9的下调有关。而Fr4对LDLR转录水平的上调作用可能与SREBP-2的激活有关。