趋磁细菌磁小体及其相关MRI报告基因分子影像学研究

张薇薇，Donna E. Goldhawk，李海龙

(1.甘肃中医药大学医学影像教研室，4.临床诊断检验教研室，5.甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室,甘肃 兰州 730000；2.罗森健康研究所医学影像项目组，安大略 伦敦 N6A 5C1；3.西安大略大学医学生物物理学系，安大略 伦敦 N6A 4V2)

报告基因指在细胞、组织或器官处于特定情况下编码可被检测的蛋白质或酶的一类基因，其表达产物易于检测。这一概念起源于20世纪80年代[1]，而将报告基因与MRI结合起来的研究可追溯至20世纪90年代[2]。最早的受体靶向MRI对比剂采用转铁蛋白受体(transferrin receptor， TfR)，之后Weissleder等[3]提出利用MRI监测体内转基因表达信息技术，使得MRI报告基因的研究越来越受到关注。磁小体由趋磁细菌经过生物矿化而形成，是1种由基因调控而成的磁性纳米颗粒，受生长环境影响，其核心成分主要是磁铁矿(Fe3O4)或胶黄铁矿(Fe3S4)；与人工合成的磁性Fe3O4纳米颗粒相比，其最大特点是自带天然形成的磷脂双层生物膜结构。磁小体具有稳定的单磁畴结构、室温下永久磁性、化学纯度高、粒径均一、晶体形态一致等特点。此外，磁小体的合成由1组特定基因控制[4]。以上诸多特性使磁小体显示出巨大的医学应用和商业化潜力。本文从MRI报告基因应用角度，对磁小体及其相关基因作为新型生物材料在分子影像学方面的研究进行综述。

1 磁小体的分子影像学应用

目前已在数种细胞模型中证实了磁小体的潜在MR对比剂用途，包括胰腺细胞[5]、脑细胞[6]及异种移植肿瘤细胞[7]，相关研究正在引起极大关注。

1.1 磁小体在肿瘤靶向MRI中的应用 有学者[7]运用组合化学(one-bead-one-compound， OBOC)技术，成功筛选出靶向表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor， EGFR)和人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2， HER2)的新肽P75，该肽可对自野生型趋磁细菌MSR-1菌株中提取的磁小体进行表面修饰，形成Mag-P75，用于肿瘤靶向MR成像；体外和体内荧光成像结果表明，Mag-P75可特异性结合人乳腺癌细胞MDA-MB-468，在肿瘤模型内显示出明显负对比增强，提示Mag-P75在MR靶向诊断EGFR和HER2阳性肿瘤中具有较高敏感度，可以作为T2加权对比剂。此外，该研究[7]还发现肽功能化磁小体具有诊断、治疗和监测肿瘤的多功能纳米粒子的潜力。Alphandéry等[8]使用磁小体链，在交变磁场作用下对小鼠颅内U87-Luc胶质瘤行磁热疗，导致病灶完全消失，表明在交变磁场作用下，从磁小体链中释放内毒素的量可控制，提示此为导致肿瘤破坏的机制之一。Erdal等[9]对磁小体与超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide， SPIO)靶向乳腺癌MDA-MB-231细胞的比较研究显示，人血清白蛋白(human serum albumin， HSA)包被的SPIO(HSA-SPIONs)与磁小体均可与荧光标记的抗EGFR抗体化学缀合。浓度为250 μg/ml的磁小体与MDA-MB-231细胞的结合率为92.0%±0.2%，而250 μg/ml的HSA-SPIONs颗粒结合率则为65.0%±5.0%；在肿瘤组织中，抗EGFR修饰后的磁小体比HSA-SPIONs颗粒具有更高的T2WI信号。此外，利用磁共生体(magneto-endosymbionts， MEs)技术，已经推出了商业化的细胞标记试剂盒，被用作基于磁铁矿的MRI对比剂来示踪细胞，其增强T2、T2*对比度的作用在体内更具优势[10]。

1.2 磁小体在磁性粒子成像(magnetic particle imaging， MPI)中的应用 极低剂量的磁小体即可被高磁场MR探测出，磁小体的高敏感度使其在对比剂领域有广阔的应用前景。Kraupner等[11]将磁小体作为磁性示踪材料用于MPI，并与商用示踪剂Resovist®的分辨率进行比较，结果表明磁小体明显优于后者。在17.2T磁场下，Mériaux等[12]比较趋磁细菌MV-1、AMB-1菌株中提取的磁小体与已商业化的MRI对比剂Ferumoxide的弛豫率，发现2种磁小体的横向弛豫率均高于Ferumoxide，而由MV-1提取的磁小体的横向弛豫率最高，约为Ferumoxide的4倍；笔者随后分别将100 μl生理血清、Ferumoxide及MV-1中提取的纯化磁小体注入小鼠脑血管并进行三维血管造影成像，发现MV-1磁小体使检测到的体素信号提高约20%。

虽然用普通培养方法生成的磁小体产量有限，磁小体的分离、纯化成本较高，但不断改进方法[13]后，这些问题逐渐得到改善。基于磁小体天然包膜的存在，目前普遍认为利用各种化学手段、蛋白融合技术修饰磁小体表面具有可行性，对于磁小体体外仿生[4]、磁小体在肿瘤诊断、磁热疗及调控肿瘤微环境乃至制备肿瘤靶向药物递送系统的研究将会进一步深入。

2 磁小体相关基因在MRI报告基因中的应用

2.1 磁小体生物矿化相关基因 对趋磁细菌AMB-1和MSR-1的系统发育研究发现磁小体生物矿化包括4个步骤[14]：①磁小体膜(magnetosome membrane，mam)从细胞质膜内陷，形成囊泡样永久内陷或分离的囊泡；②在内陷前或后，磁小体蛋白被分选到mam；③铁被转移到磁小体囊泡中，并被矿化为磁铁矿晶体；④组装并定位磁小体链，以在细胞分裂期间分离。迄今已有50多种编码磁小体相关蛋白的基因通过鉴定[14]。磁小体生物矿化特定功能均与1组约30个聚集在单个染色体区域的基因有关，称之为基因组磁小体岛(magnetosome island， MAI)，包含mam基因和磁性粒子-膜特异性(magnetic particle-membrane specific， mms)基因。有研究[15]将mam、mms等相关基因用于MRI报告基因，发现其在分子影像学中的表现较提取分离出的磁小体更好。

2.2 MagA基因在MRI报告基因中的应用 成功分离MagA基因后[16]，进一步明确了MagA与铁调控的关系[17-18]。虽然其后趋磁细菌MSR-1菌株未能检测到MagA[19]，且MagA位于MAI外[20]，但近年来针对MagA基因的相关分子影像学研究[21]显示，MagA基因赋予哺乳动物细胞磁性，是一种候选MRI报告基因。

MagA在小鼠神经母细胞瘤N2A细胞中表达时，细胞质内可见磁小体样颗粒聚集[21]，MagA活性对铁补充有反应，细胞MRI对比度也因此增强，从而有助于进行非侵入性细胞内MR成像；且MagA无细胞毒性，同时还能调节细胞铁稳态，但该基因可能不受哺乳动物细胞中转铁蛋白受体-铁蛋白轴的铁稳态调节。进一步优化MR弛豫率测量方法后，研究[22]表明由MagA表达的磁小体样颗粒较人重链和轻链铁蛋白亚基表达的转铁蛋白具有更高的MRI信噪比。此外，通过慢病毒转染可建立携带四环素反应元件(TRE)Tet-On的Tet-MagA小鼠胚胎干细胞系mESC-MagA，且可通过含有和不含MagA的小鼠胚胎干细胞系(mESC-MagA和mESC-WT)来评估移植小鼠在小鼠胚胎干细胞系中表达MagA的影响[23]。一项7.0T MR扫描仪在监测体内具有强力霉素Dox诱导表达和非诱导表达的细胞及动物模型颅内成像研究[23]显示，mESC-MagA可导致T2WI和磁敏感加权图像信号显著变化。

Guan等[24]制备了用于MRI的MagA转基因小鼠，并评估其抗氧化酶、脂质过氧化和细胞因子的产生，发现铁超负荷后，与野生型小鼠相比，MagA转基因小鼠较少发生氧化应激水平的明显变化，也未表现出明显病理症状或组织学变化；在MRI信号方面，MagA过度表达导致横向弛豫率(R2)改变，MRI可检测到铁过载小鼠R2中的转基因依赖性变化。有学者[25]利用MagA转基因小鼠评估间充质干细胞中铁超负荷和迅速铁螯合疗法是否可以同时增加MRI检测铁的敏感度，并减弱对造血微环境的氧化损伤，发现与对照组细胞相比，在铁补充剂存在下，间充质干细胞表达MagA的R2*更高；与野生型小鼠相比，来自铁过载MagA转基因小鼠肝脏的R2*值高；此外，MagA有助于降低铁对间充质干细胞的细胞毒性，降低p-p38丝裂原活化蛋白激酶和铁蛋白的表达，并减少铁过载引起的成骨分化抑制作用。

Pereira等[26]重新观察从趋磁细菌MS-1菌株分离出来的MagA作为MRI报告基因的功效,发现人胚胎肾细胞HEK耐受MS-1 MagA基因的组成型表达，但在小鼠间充质/基质细胞和肾源性干细胞中诱导出强烈的毒性作用，严重限制MS-1 MagA基因作为干细胞报告基因的有效使用;该研究还指出，尽管有人提出MS-1 MagA参与铁转运，但当其在HEK细胞中表达时，不会影响与铁稳态相关的内源基因的转录；MagA诱导的HEK细胞中铁摄取的信号增强微不足道，表明即使对于能够耐受其表达的细胞类型，该基因也是差的报告基因，即MagA作为报告基因须谨慎使用，且其功效因细胞种类不同而异，特别是用于与再生疗法相关的细胞时；此外，尽管癌细胞能耐受其表达，但必须注意确保其不会影响细胞稳态。还有研究[20]指出，过量表达MagA细胞中的电子密集斑点实际上是铁蛋白聚集体，而非磁小体纳米颗粒本身。

2.3 mms6基因在MRI报告基因中的应用 mms6基因是MAI基因之一，与磁小体颗粒的合成、大小和分布密切相关。除在微生物学方面外，对该基因的研究还涉及绿色仿生纳米粒子[27]。近期有学者[28]利用mms6基因进行MRI报告基因研究，其将mms6融合至鼠h-铁蛋白的C-末端蛋白，作为新的嵌合磁性铁蛋白报告基因，使得铁蛋白生物矿化并使神经胶质瘤细胞R2增强；即使在没有外源性铁补充的情况下，表达mms6的肿瘤也能与不表达mms6的亲代肿瘤区分开，但其潜在细胞毒性问题尚待澄清，mms6是否是一种有效遗传MRI报告基因有待确定。

2.4 其他磁小体相关基因 鉴于已鉴定了50多种编码磁小体相关蛋白的基因，该领域研究将有很大发展空间。相信对磁小体mamI和mamL基因在哺乳动物细胞中表达的研究[29]将会取得进一步成果。

3 展望

报告基因是分子工程的工具，可评估活细胞和整个生物体内特定启动子的转录活性的位置、持续时间和程度。磁小体基因敲除研究[30]提出了1种可能性，即部分基因可用于在多种细胞类型中产生最小区室，允许铁生物矿化用于非侵入性MR医学成像。利用将磁小体生物矿化相关基因转移到其他微生物的能力，很可能实现以更经济的方法生产、纯化磁小体，促进磁小体在生物技术和纳米技术中的应用。生物安全性、细胞毒性是磁小体和磁小体相关基因利用过程中必须关注的问题，将是今后的研究方向之一。

总之，新的基因组学技术正在影响着医学的每一个领域。基因组学和影像学的发展和结合诞生了一门新的学科——影像遗传学。磁小体及其相关基因的研究为MRI生物医学成像提供了新的可能性。未来相关领域的研究工作将会面临很多挑战，同时也为诊治疾病带来更多机遇。