Wnt信号通路在骨肉瘤发生机制中作用的研究进展

张熙 王东伟 刘爽

佳木斯大学（黑龙江佳木斯 154007）

骨肉瘤是起源于成骨间叶组织的原发性恶性骨肿瘤，约占小儿恶性肿瘤的5%。同时，骨肉瘤发病机制不明，预后较差，伴有较高的复发率和转移风险［1］。因此，研究骨肉瘤发生发展机制对于预防、优化临床治疗方案，提高患者生存率具有深远的意义。

近年来骨肉瘤细胞遗传学和分子生物学机制已有了较为深入的研究，原癌基因C-myc、erbB-2、SAS等，抑癌基因 Rb、p53、DCC、PTEN等，以及血管内皮生长因子、环氧合酶-2等都已证实与骨肉瘤存在着密切关系。

一般认为，骨肉瘤的发生是由于成骨细胞分化异常所致，而Wnt/β-Catenin在成骨细胞的增殖、分化以及迁移过程中扮演着重要角色，许多骨肿瘤中已发现Wnt/β-Catenin信号通路的异常激活。异常的Wnt/β-Catenin信号通过上调致癌基因（如c-Myc、CCND1、c-MET）引起骨肉瘤的发生［1］。越来越多的研究表明Wnt/β-Catenin信号分子与骨肉瘤的发生发展存在着密切关系，本文综述了wnt信号分子在骨肉瘤发生发展中的影响，望其成为治疗骨肉瘤的突破口。

1 经典Wnt信号通路

目前，Wnt信号通路分为β-catenin依赖型经典Wnt信号通路和β-catenin非依赖型非经典wnt信号通路。非经典Wnt信号通路包括Wnt/Ca2+通路及Wnt/JNK通路。其中，经典Wnt信号通路被认为是最为关键且研究最多的Wnt信号通路。经典Wnt信号通路是一种在进化中高度保守的信号通路，在调节细胞迁移、极化、分化等方面发挥着重要作用。多篇文献提出Wnt信号通路在骨骼恶性肿瘤以及肿瘤骨转移灶中异常激活，如多发性骨髓瘤，尤文氏肉瘤，骨肉瘤，以及乳腺癌或前列腺癌骨转移瘤。

经典Wnt信号通路作用机制是当Wnt配体蛋白存在时，Wnt蛋白与受体一旦结合将磷酸化低密度脂蛋白关联受 体 5/6（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP5/6），进一步与卷曲蛋白（Frizzled，Fz）形成Fz-LRP5/6复合体。Fz蛋白作用于胞质内的蓬乱蛋白（Dishevelled，Dsh），因Dsh和轴蛋白（Axin）都含有DIX结构域，易聚合，故促进了复合物（Wnt-Fz-LRP5/6）形成。LRP5/6因子的PPPSPXS区域磷酸化后与Axin结合，并且Axin、GSK3、CK1复合体形成又可促进激活LRP5/6因子的PPPSPXS区域，进一步导致Axin蛋白与LRP5/6的结合。与LRP5/6结合的Axin将不能与GSK-3/APC形成复合物，导致β-catenin不能被降解，没有被降解的β-catenin在胞质内积累、聚集并进入细胞核与T细胞转录因子（TCF）/淋巴增强因子（LEF）结合形成复合体，β-catenin代替Croucho、Coop等抑制转录因子与TCF结合，从而激活下游靶基因转录，促进细胞分化增殖。当没有wnt信号分子时，细胞质内累积的β-catenin与细胞膜上E-钙粘蛋白（E-cadherin）结合，使之附着于细胞骨架蛋白肌动蛋白上，介导细胞与细胞之间粘附，少部分的β-catenin通过泛素化途径被降解，导致TCF/LEF与多种转录抑制蛋白结合而阻止靶基因的表达［2］。

Wnt通路通过调控转录激活剂发挥作用，同时也受到分泌蛋白的调控，如wnt蛋白抑制因子（WIF-1）和分泌型卷曲蛋白（SFRP1）会抑制Wnt与Fz受体结合；Dickkopf相关蛋白 1（Dickkopf-related protein 1，Dkk1）能阻止 Wnt与LRP相互作用，从而抑制Wnt信号通路的激活［3］（图1）。

2 经典Wnt通路与骨肉瘤发生发展的相关性

2.1Wnt配体蛋白与骨肉瘤的相关性Wnt蛋白是一类富含糖基化位点的自分泌或旁分泌糖蛋白，由wnt基因编码作为Wnt通路的起始蛋白［4］。

Wnt蛋白在成骨细胞中对其增殖、分化和迁移起着调节作用，并且在小鼠模型中对骨愈合起着重要的成骨作用。目前，研究发现Wnt受体、Wnt配体蛋白以及wnt抑制蛋白分泌的减少与骨恶性肿瘤密切相关。已经发现骨肉瘤细胞株（U2OS，HOS，143B和Saos-2）中wnt1，wnt4，wnt5a，wnt7a，wnt14蛋白表达，wnt5a和wnt7a在4种细胞株中均有表达，wnt4和wnt1也在2种细胞株中表达［5］。HOANG等［6］发现wnt1蛋白在HOS和Saos-2骨肉瘤细胞中表达增高；而HOS，143B和Saos-2表达wnt4；U2OS，HOS，143B和Saos-2中wnt5a和wnt7a均有一定的表达；4种细胞株中均没有检测到wnt11的表达。

图1 经典Wnt信号通路Fig.1 Classic Wnt pathway

另外，在人骨肉瘤细胞系MG63和HOS中也发现了多种wnt配体蛋白的表达。有学者在两种鼠骨肉瘤细胞系K7M2 和 K12 中 发现 Wnt2，Wnt3，Wnt5a，Wnt6，Wnt7a，Wnt8a，Wnt10b，Wnt15配体蛋白表达。这些结果通过离体和临床检测都验证了骨肉瘤的发生可能激活wnt相关蛋白。证明wnt配体蛋白通过自分泌或旁分泌的方式参与了骨肉瘤的发生发展。

MA等［10］用实时定量PCR研究比较了人骨肉瘤细胞（Saos-2）与人胚胎成骨细胞（hFOB）Wnt/β-Catenin信号通路组件的表达情况，发现Saos-2细胞的wnt3a、β-Catenin及LEF1较hFOB细胞高度上调［7］。基于这些研究，在骨肉瘤中多种wnt配体蛋白的过度表达表明wnt配体蛋白通过Wnt/β-Catenin信号通路及其下游相关基因使骨肉瘤发生，这为通过阻断上游wnt相关蛋白抑制骨肉瘤的发生提供了新思路。

2.2Frizzled蛋白因子在骨肉瘤中的作用经典Wnt/β-catenin通路中wnt配体蛋白必须与膜上受体卷曲蛋白（Frizzled，Fz）结合才能发生级联信号产生信号转导。Frizzled蛋白作为wnt配体蛋白家族的主要受体，最初是从鼠骨肉瘤细胞系UMR-106中发现的，仅存在于动物细胞中［8］。Frizzled蛋白受体由细胞外N端保守的半胱氨酸富集结构域（CRD）、类似G蛋白偶联受体的七次螺旋跨膜区和细胞质内C端的PDZ结构域组成。低密度脂蛋白相关受体（LRP）是细胞表面分子，为经典Wnt信号通路中识别wnt配体蛋白的共受体。当Wnt信号激活时，Wnt配体蛋白与细胞膜上的Frizzled受体与跨膜分子LRP5/6形成复合体共同将细胞外的Wnt蛋白信号转导至细胞内［9］。

HOANG等［9］用RT-PCR在骨肉瘤细胞株（U2OS，HOS，143B和Saos-2）中研究wnt蛋白受体的表达情况，发现Frizzled1、Frizzled2、Frizzled4、Frizzled5、Frizzled9和LRP5在这4种细胞株中均有表达，而Frizzled8在其中的3种细胞中有表达，Frizzled3只在143B细胞中出现表达。同时发现在44例骨肉瘤患者中，50%的患者活检切片有LRP5表达。提出LRP5在mRNA中的表达似乎与人类骨肉瘤的转移潜能有明显的联系，可以作为骨肉瘤进展的候选标记［6］。在Saos-2中阻断LRP-5信号通过E-cadherin/β-catenin通路抑制细胞上皮-间叶转化，导致细胞活性降低。用LRP5抑制剂阻断Wnt信号后肿瘤进程相关蛋白［钙粘蛋白N（N-cadherin）、转录因子Snail、基质金属蛋白酶2（MMP2）］下调，阻碍裸鼠体内骨肉瘤生长和迁移，这些证据表明LRP5可能成为辅助骨肉瘤治疗的靶点。

最近发现在不同年龄犬骨肉瘤细胞中Frizzled6的表达均明显高于犬成骨细胞［10］，这使Frizzled6可能作为骨肉瘤细胞的标志物。同时，骨肉瘤组织与其邻近非肿瘤组织以及骨肉瘤细胞与正常细胞中Frizzled8的表达情况的比较中，发现Frizzled8在骨肉瘤中被高度上调［11］。这些研究都表明Frizzled作为经典Wnt/β-catenin通路的主要受体与骨恶性肿瘤（骨肉瘤）有密切的相关性。

2.3β-catenin蛋白因子在骨肉瘤中的作用β-catenin是经典Wnt/β-catenin通路中的核心蛋白，含有12个armadillo重复区的棒状超螺旋结构，可防止蛋白水解，在细胞的信号传递中有重要作用［12］。β-catenin主要位于细胞膜，少量游离在细胞质。当Wnt信号通路未激活时，β-catenin通常被磷酸化，然后经泛素酶途径降解［2］。

β-catenin与骨恶性肿瘤的关系已经得到了越来越多的关注，许多研究已经发现了骨肉瘤中β-catenin的聚集。在小鼠骨肉瘤细胞（LM8）和Dunn骨肉瘤细胞的细胞质和/或细胞核中同样发现了β-catenin蛋白染色。LM8细胞具有高度的肺转移潜能，而其β-catenin染色明显高于原位癌Dunn细胞，这表明β-catenin是骨肉瘤肺转移潜在生物学标志。值得注意的是，这两组研究的基因序列分析都没有检测到β-catenin基因外显子3片段上的突变，这表明骨肉瘤中β-catenin的积聚不是由于自身的突变造成，而可能是在Wnt通路的调节中发生的变化。

敲除β-catenin会提高甲氨蝶呤诱导Saos-2细胞死亡率，抑制β-catenin蛋白能够增强甲氨蝶呤对Saos-2细胞的凋亡作用［7］。β-catenin作为经典Wnt/β-catenin通路中实现细胞核内外信号转导的关键信号因子，其本身能与细胞膜上的E-cadhine结合影响细胞的粘附，许多研究已经发现其在骨肉瘤中异常表达，影响骨肉瘤的发生、发展及转移。这对于抑制骨肉瘤转移性的研究具有较为深入的作用。

2.4细胞核内因子LEF1对骨肉瘤的作用淋巴样增强因子-1（LEF1）是 T 细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）家族成员之一，为高迁移率组分（HMG）转录因子。LEF-1蛋白主要有两个功能结构域，一是羧基端的DNA结合域，即HMG-Box；另一个是氨基端的β-catenin结合域。β-catenin进入细胞核后与LEF-1的氨基端β-catenin结合域结合，LEF-1羧基端HMG-Box可以结合靶基因启动子区域，进而激活下游靶基因（c-myc、cyclin D1、MMP-7等），导致细胞异常增殖。

LEF1与骨肉瘤的发生和转移有一定的关系。有研究在Saos2细胞和人成骨细胞中均发现LEF1被上调［7］。另外，通过免疫组化法发现LEF1在骨肉瘤组织中高表达，并用Western blot和RT-PCR检测到与低增殖转移能力的骨肉瘤细胞（F4）相比，高增殖转移能力的骨肉瘤细胞（F5M2）中LEF1表达增高［13］，提示LEF1可能与骨肉瘤转移存在正相关。

2.5经典Wnt/β-catenin通路中其他因子与骨肉瘤的作用经典Wnt/β-catenin通路也受到一些抑制因子的调控。Wnt抑制剂主要分为两大类，其中包括通过竞争性结合wnt受体复合物的LRP5/6来抑制Wnt信号通路的DKK家族蛋白；以及直接与Wnt配体结合从而抑制Wnt信号通路的Wif-1、frizzled相关蛋白（sFRP）家族等［14］。研究已经发现这些Wnt信号通路抑制因子在骨肉瘤中具有抑制肿瘤发生和转移的潜能。

DKK家族蛋白是一类与Wnt信号通路共受体LRP5/6结合，从而抑制经典Wnt信号转导的糖分泌蛋白。DKK3通过调节Wnt信号通路而被作为肿瘤抑制因子。有研究显示在骨肉瘤细胞中DKK3使β-catenin重新分配到细胞膜上，聚集在细胞膜上的β-catenin与E-cadherin结合形成复合体，阻止β-catenin的核内转位，从而抑制wnt信号通路下游TCF/LEF转录因子的激活，而E-cadherin与肿瘤侵袭密切相关。因此，DKK3可能降低骨肉瘤生长及转移能力［15］。

Wif-1是一种Wnt配体拮抗剂，Wif-1的超甲基化在许多人类肿瘤中已经被证实，例如鼻咽癌、肺癌、中皮瘤、乳腺癌和胃癌［16］。研究表明，在大多数骨肉瘤细胞和组织中Wif-1被下调，并且在小鼠骨肉瘤组织中重新表达Wif-1减少了肿瘤生长和肺部转移能力［17］。体研究显示，Wif-1是成骨细胞分化所必需的，而组织中Wif-1的减少和丢失会激活wnt信号通路，加速骨肉瘤的进展［18］。还有许多因子能够影响Wnt/β-catenin信号通路，进而影响骨肉瘤的发生、发展以及转移。研究已发现针对骨肉瘤的治疗中其相关因子发生了改变，如sFRP家族一些蛋白等，这为骨肉瘤靶向治疗提供了更多的研究基础。

3 总结

Wnt/β-catenin信号通路在一些骨恶性疾病中扮演着重要的角色。在骨肉瘤中，许多Wnt/β-catenin信号通路中的蛋白过度表达，包括Wnt配体蛋白、Frizzled受体、LRP5/6、β-catenin以及一些核内转录因子TCF/LEF等。同时，基因编码内源性Wnt通路抑制剂，如：Wif-1、DDK3等的表观遗传沉默。这些现象都强调了异常Wnt信号在骨肉瘤发生、发展以及转移中的重要影响。

虽然学者对Wnt/β-catenin信号通路在骨肉瘤中的机制有所了解，但仍有许多具体调控机制待研究。例如：在骨肉瘤中，Wnt配体与其受体是如何相互作用的；哪些信号蛋白对骨肉瘤的发生和进展发挥着关键性调节以及识别作用。骨肉瘤的发展是一个极为复杂的过程，涉及多种分子信号通路，而Wnt/β-catenin信号通路也与其他多条信号通路，如Notch、TGF、MAPK通路中的信号因子存在crosstalking。这些复杂的信号通路是如何在骨肉瘤中相互交叉发挥作用的需要更多更全面的研究。因此，经典Wnt/β-catenin信号通路在骨肉瘤中的具体作用机制仍需更多深入的探索。