敲低肝细胞核因子1α基因对胰腺癌BxPC-3细胞增殖及迁移的影响

罗招凡 郑上游 赵书琴

1中山大学附属第七医院检验科（广东深圳 518017）；2中山大学孙逸仙纪念医院胆胰外科（广州 510120）

胰腺癌是一种发病隐匿、发展迅速、恶性程度极高的消化道恶性肿瘤，易局部复发，肝脏、淋巴结转移率高，90%患者死于肿瘤的侵袭转移，近年来其发病率逐年升高［1-2］。LI等［3］通过全基因组相关性研究（GWAS）鉴定出肝细胞核因子1α（HNF1α）为胰腺癌相关易感基因，但其具体作用未明。肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factors，HNFs）主要表达于肝脏、肾脏、胰腺等组织，是一类在肝脏优势表达的转录因子，调控肝脏、胰腺等组织特异基因的表达。近来HOSKINS等［4］通过在胰腺癌细胞株（PANC-1、MIAPaCa-2）中过表达HNF1α，发现胰腺癌细胞生长受抑、凋亡增加，认为HNF1α在胰腺癌的发生发展中可能起着抑癌作用。本研究拟在此基础上，利用siRNA技术抑制HNF1α的表达，研究其对胰腺癌细胞株BxPC-3增殖、迁移的影响，拟进一步明确HNF1α在胰腺癌中的作用。

1 材料与方法

1.1材料与主要试剂BxPC-3细胞株购自ATCC（American Type Culture Collection），本室保存。胎牛血清、RPMI-1640培养基、0.25%Trysin-EDTA、Trizol及Invitrogen GoldScript一步法RT-PCR试剂盒（美国Life公司）；HNF1α siRNA及阴性对照siRNA、siPORTNeoFX转染试剂盒（美国Ambion公司）；DNA Marker（东盛生物）；第一链cDNA合成试剂盒、SYBR®Fast qPCR Mix（TaKaRa生物有限公司）；HNF1α抗体（Abcam）；β-actin抗体（美国Sigma公司）；引物（广州艾基生物有限公司）；Cell Titer-GIo发光试剂盒（美国Promega公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（美国BD公司）；Transwell小室（美国BD公司）。

1.2细胞培养BxPC-3细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3siRNA转染BxPC-3细胞株根据GeneBank HNF1α基因已知序列（Accession No.NM_000545），已确证的HNF1α siRNA由Ambion公司提供，HNF1α siRNA正义链：5′-CAGUGAGACUGCAGAAGUAtt-3′。实验分为3组，设为空白对照组（mock group，未转染siRNA）、阴性对照组（control group，转染阴性对照siRNA）和HNF1α沉默组（HNF1α siRNA group，转染HNF1α siRNA）。取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化制成细胞悬液，以1.0×105个/孔铺于6孔板，分别加入转染液、HNF1α siRNA、阴性对照siRNA。试验至少重复3次。

1.4RNA的提取及实时定量RT-PCR转染48 h后，TRIZOL提取总RNA，运用第一链合成试剂盒将RNA逆转录为cDNA。逆转录反应的反应体系：Oligo dT Primer 1 μL，dNTP Mixture 1 μL，模板RNA 5 μL，ddH2O 3 μL，65 ℃保温5 min 后，冰上迅速冷却。在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：5× Prime Script II Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Prime Script II RTase 1 μL，RNase free ddH2O 4.5 μL。反应条件：42 ℃ 45 min，95 ℃5 min后，冰上冷却。Real-time PCR引物：HNF1α-F：CAGGGAGGGCTGATTGAAGA；HNF1α-R：CCCCACTTGAAACGGT；GAPDH-F：ACCCAGAAGACTGTGGATGG；GAPDH-R：CAGTGAGCTTCCCGTTCAG。运用Takara的SYBR®Fast qPCR Mix进行实时荧光定量PCR。反应体系为25 μL，SYBR Fast qPCR Mix（2x）12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL，ROX Reference Dye（50X）0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 8 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 32 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，运用2-ΔΔCt相对定量法进行数据分析。

1.5Western blot实验转染72 h后，收集6孔板细胞，加200 μL裂解液，按Western印迹操作流程进行检测，用Image-Quant分析软件测定结果中条带灰度值，以目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值表示各组蛋白的相对表达量。

1.6细胞增殖实验BxPC-3细胞消化稀释，按104个/孔接种于96孔板，同时设空白调零孔，每组设置5个平行复孔。分别在转染12、24、48、72 h后，每孔加入等体积Cell Titer-GIo试剂，检测发光值。

1.7细胞凋亡实验转染72 h后，使用不含EDTA的胰酶消化BxPC-3细胞，用预冷PBS洗涤2次，1×Binding buffer悬浮细胞，细胞浓度为1×106个/mL，取100 μL悬液（1×105个细胞）至5 mL试管，加入5 μL FITC AnnexinV及5 μL PI，混合后室温避光孵育15 min，每管加入400 μL 1 × Binding buffer，1 h内用流式细胞仪检测。

1.8Transwell细胞迁移实验转染48 h后，将BxPC-3细胞消化，用RPMI-1640培养液稀释至5×105个/mL单细胞悬液，取200 μL细胞悬液加入transwell小室上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液。在37℃，5%CO2培养箱中孵育20 h后，取出上室，弃去培养液，用棉签擦去上室未迁移的细胞。0.025%结晶紫染色30 min，PBS洗涤3次，显微镜下随机选择5个视野细胞并拍照计数。

1.9统计学方法实验用不同批次细胞重复3次以上，采用SPSS 17.0软件，多组数据间比较采用单因素方差分析（One way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HNF1α siRNA对BxPC-3细胞HNF1α mRNA及蛋白表达的影响转染了靶向HNF1α siRNA（siRNA）48 h后，与阴性对照组比较，BxPC-3细胞HNF1α mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），而空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。同时，转染72 h后Western blot结果显示，HNF1α siRNA敲低组HNF1α蛋白表达显著低于阴性对照组（P＜0.05），而两对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2Cell Titer-GIo发光法检测BxPC-3细胞生长情况采用Cell Titer-GIo发光法分别于转染HNF1α siRNA 后12、24、48、72 h检测BxPC-3细胞生长情况。结果显示，HNF1α敲低组BxPC-3细胞的增殖活力明显高于阴性对照组（P＜0.05），而两对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

2.3Annexin V-FITC/PI法检测BxPC-3细胞凋亡率转染72 h后，采用AnnexinV-FITC/PI双染细胞，使用流式细胞仪检测3组BxPC-3细胞凋亡情况。结果显示，HNF1α敲低组（siRNA）细胞凋亡率显著低于阴性对照组（2.19%vs.48.37%，P＜0.05），而两对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图1 各组BxPC-3细胞HNF1α mRNA及蛋白表达水平Fig.1 Expression of HNF1α mRNA and protein in each group of BxPC-3 cells

图2 HNF1α siRNA对BxPC-3细胞生长的影响Fig.2 Effect of HNF1α siRNA on the growth of BxPC-3 cells

图3 HNF1α siRNA对BxPC-3细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of HNF1α siRNA on the apoptosis of BxPC-3cells

2.4 Transwell法检测BxPC-3细胞迁移能力转染了特异HNF1α siRNA后，transwell结果显示，HNF1α敲低组BxPC-3细胞迁移能力显著高于阴性对照组（P＜0.05），而两对照组之间差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图4。

3 讨论

HNFs是一类在肝脏优势表达的转录因子，包括HNF1、3、4、6、CCAAT/增强子结合蛋白和D-结合蛋白，其中HNF1包括HNF1α、HNF1β两个成员，HNF1α又名LFB1/TCF1，是一个含有变异同源结构域的转录因子，它定位于人染色体12q24.2，表达于肝、肾、肠和胰腺组织中，是肝脏富集转录因子家族成员之一，可调控多种组织特异基因的表达［5］。

图4 HNF1α siRNA对BxPC-3细胞迁移的影响（×40）Fig.4 Effect of HNF1α siRNA on the migration of BxPC-3 cells（× 40）

已有研究显示HNF1α与肝细胞癌（HCC）的发生发展密切相关［6］，且是维系肝细胞分化表型的重要转录因子［5］，在高分化的肝癌细胞中，HNF1α的表达水平高，反之表达减低，在去分化的肝细胞中回转HNF1α能够恢复肝细胞的分化表型［7］。PELLETIER等［8-9］发现HNF1α在HCC细胞和组织中表达下调，且HNF1α表达下调可促进上皮来源的HCC细胞发生上皮间质转化，从而具有更强的迁移和侵袭能力。以上研究表明HNF1α在肝细胞癌中是一种抑癌基因。然而，在胰腺癌中HNF1α表达减低或缺失的作用不是很明确，相关文献报道有限。

本研究组前期研究发现，与胰腺癌旁的正常组织相比，胰腺癌组织中HNF1α表达显著降低［10］，HNF1α mRNA相对表达量降至正常对照的0.44，蛋白水平也相应降低，约为正常对照的一半，提示其可能参与了胰腺癌的发病过程。本研究通过siRNA技术抑制BxPC-3细胞HNF1α表达，以探讨HNF1α对胰腺癌BxPC-3细胞生长、凋亡和迁移的影响。结果显示，下调HNF1α表达后可显著促进胰腺癌BxPC-3细胞生长、抑制凋亡，并促进细胞迁移。这也与ZENG等［11］报道的过表达HNF1α几乎可完全抑制肝癌细胞株Hep3B、Huh7在裸鼠体内的成瘤性结果相类似。另外KRÜTZFELDT等［12］也发现，在HNF1α基因敲除小鼠中，肝组织miR-192/194表达显著下调，其下游靶基因Fzd6表达显著上调，提示HNF1α可能通过调控miR-194及其靶基因Fzd6表达而抑制HCC发生。HELLERBRAND等［13］也发现HNF1α在HCC细胞和组织中表达下调，并与抑癌基因MIA2表达下调显著相关，恢复HNF1α表达可重新诱导MIA2表达，继而可显著抑制HCC细胞的增殖、侵袭能力以及移植瘤的生长、侵袭，表明HNF1α表达缺失可引发HCC。与以上结果一致，HOSKINS等［4］通过在胰腺癌细胞株中过表达HNF1α，发现胰腺癌细胞生长受抑，凋亡增加，提示HNF1α也可能在胰腺癌癌发病中起着重要的抑癌作用。

综上所述，采用HNF1α siRNA可以成功敲低胰腺癌BxPC-3细胞中HNF1α基因的表达，HNF1α基因敲低后胰腺癌BxPC-3细胞的增殖和迁移能力均上升，细胞凋亡减低。这一结果可能为临床治疗胰腺癌的转移提供了一个新的干预靶点。但HNF1α对胰腺癌BxPC-3细胞生长及迁移影响的机制尚不清楚，本课题组将继续深入探讨其具体调控机制，为胰腺癌的分子靶向治疗提供更加科学的理论依据。