脑梗死患者MTHFR基因C677T多态性与同型半胱氨酸水平的相关性

朱嫦琳 陈斌鸿 薛雄燕 潘练华 李炜煊

佛山市第一人民医院检验科（广东佛山528000）

脑梗死是最常见的脑血管疾病之一，其发生发展受多种因素的影响，除了常见的高血压、高血脂等因素外，血液中同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高是脑梗死发生的独立危险因素［1-2］。Hcy在体内的代谢受亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）的调节。MTHFR是叶酸代谢过程中的关键酶，具有单核苷酸多态性，多态性位点的变化可导致其编码的酶活性发生改变，引起血清叶酸水平异常，从而导致Hcy水平升高［3］。本研究通过分析脑梗死患者MTHFR基因多态性分布特点，并比较糖尿病性脑梗死患者和非糖尿病性脑梗死患者血浆Hcy水平的差异，明确脑梗死患者MTHFR基因C677T多态性与Hcy水平的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料病例组256例脑梗死患者选自2016年6月至2018年5月佛山市第一人民医院神经内科及康复医学病区，男174例，女82例，年龄29～92岁，平均（65.9±11.3）岁。糖尿病性脑梗死患者68例，非糖尿病性脑梗死患者188例。对照组208例为同期体检者，男145例，女63例，年龄28～89岁，平均（64.1±10.8）岁。两组对象在年龄和性别上差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究方案经医院伦理委员会审核通过，所有研究对象或监护人均签署知情同意书。

针对难以坐位的患儿,患儿家长要抱着患儿,促使膈肌下移,促使患儿气体交换量增加,便于雾化液滴在终末细支气管内沉降。在吸入过程中,教导患儿缓慢地进行深呼吸,如果患儿不能学会这种呼吸方式,则教导其张口呼吸。在患儿在治疗过程中,护理人员要对患儿的面色、表情以及情绪进行密切观察,一旦发现患儿异常状况,要及时告知医生并采取方式处理。

这些问题我们是解答不了的，因为除了按书本章节背了一些理论外，其他就不甚了了。巴克夏被问得支支吾吾，满头冒汗，求援似的望着我。我灵机一动，连忙遮掩：“大家问的都是关于农作物的疾病与虫害部分，将来会讲到的，现在暂不涉及——”

1.2纳入标准及排除标准病例组患者均符合1995年全国第四届脑血管会议修订的脑梗死诊断标准［4］，其中糖尿病性脑梗死患者均符合2016年ADA糖尿病诊断标准［5］，并排除恶性肿瘤、外周静脉血栓疾病、严重肝肾疾病及代谢性疾病等。对照组人群除符合以上排除标准外，还排除所有脑梗死、冠心病、糖尿病患者。所有研究对象之间均无直系血缘关系。

脑梗死的发生发展受到遗传因素和环境因素的共同作用，包括高血压、糖尿病、高脂血症、饮食不当、饮酒过量、过度的精神压力等。目前关于脑梗死的研究众多，有研究指出，MTHFR基因多态性与脑梗死具有一定相关性［6-7］。MTHFR基因C677T位点可发生突变，胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，使MTHFR活性和耐热性下降，引起血清叶酸水平异常，进而导致高Hcy血症，在血栓性疾病中起着重要的作用。

2.1病例组与对照组MTHFR基因C677T位点的基因分型对病例组和对照组的MTHFR基因C677T位点的3种基因型分布进行Hardy-weinberg平衡检验，符合遗传平衡法则（P＞0.05），说明样本具有代表性。两组间基因分型比较结果显示，在256例脑梗死患者中，CC型136例（53.1%），CT型89例（34.8%），TT型31例（12.1%），208例对照者中，CC型136例（65.4%），CT型64例（30.8%），TT型8例（3.8%），两组间MTHFR基因型分布差异具有统计学意义（χ2＝12.821，P ＜ 0.001），其中病例组TT型的比例显著高于对照组（χ2＝10.178，P＝0.001），CC型的比例则显著低于对照组（χ2＝7.111，P＝0.008）。病例组C和T等位基因频率分别为70.5%、29.5%，与对照组（分别为80.8%、19.2%）基因频率分布差异具有统计学意义（χ2＝12.927，P ＜ 0.001）。见表1。

1.4仪器和试剂所有对象在清晨空腹采取静脉血，其中，EDTA-K2抗凝管采集全血2 mL用于MTHFR基因C677T多态性检测，绿色肝素钠抗凝管采集全血2 mL后经3 500 r/min离心15 min，分离上层血浆用于Hcy检测。亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T检测试剂盒（PCR-RFLP）购自深圳市奥萨制药有限公司，检测仪器为ABI公司7500荧光实时定量PCR仪。Hcy检测采用Siemens公司ADVIA2400全自动生化分析仪及配套试剂。所有操作严格按照说明书。

2.3 病例组与对照组不同MTHFR基因型的Hcy水平比较结果显示，病例组脑梗死患者总体血浆Hcy水平以及各基因型患者的血浆Hcy水平均显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。对不同基因型研究对象间的Hcy水平的比较结果显示，病例组TT型患者的Hcy水平显著高于CC型及CT型（F＝26.291，P＜0.001），而病例组CC型和CT型之间、以及对照组各基因型间Hcy水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

1.3检测原理MTHFR基因C677T多态性采用聚合酶链式反应和限制性片段长度多态性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）的方法，扩增产物由识别多态性位点的特异性核酸内切酶进行酶切，酶切片段经电泳分析，根据电泳条带区分基因型；血浆Hcy采用循环酶法检测。

1.5统计学方法采用统计学软件SPSS 19.0进行数据处理。等位基因频率的Hardy-Weinberg（HW）平衡采用拟合优度χ2检验，两组间的基因型及基因频率比较采用χ2检验，计量资料符合正态分布，两组间Hcy水平比较采用独立样本t检验，不同基因型之间Hcy水平比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

(2)阻垢剂静态阻垢实验。实验参照Q/SY 126-2014《油田水处理用缓蚀阻垢剂技术规范》进行。利用静态阻垢法测定两种阻垢剂对CaCO3垢的阻垢性能，同时做2组空白试验。

2.4 糖尿病脑梗死患者与非糖尿病脑梗死患者不同MTHFR基因型的Hcy水平比较结果显示，糖尿病脑梗死患者血浆Hcy平均水平低于非糖尿病脑梗死患者，但差异无统计学意义（t＝1.578，P＝0.116），其中糖尿病脑梗死组TT型患者血浆Hcy水平显著低于非糖尿病脑梗死组（t＝2.929，P＝0.007），而两组CC型和CT型患者血浆Hcy水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表1 病例组与对照组MTHFR基因C677T位点的基因分型比较Tab.1 Comparison of MTHFR gene C677T polymorphism between case group and control group 例（%）

表2 糖尿病脑梗死患者与非糖尿病脑梗死患者MTHFR基因C677T位点的基因分型比较Tab.2 Comparison of MTHFR gene C677T polymorphism in cerebral infarction patients with or without diabetes mellitus 例（%）

2.2.1建成区扩展数量和强度德州市主要建成区从1997年的85.39 km2增加到2017年的151.56 km2，净增长面积达66.17 km2，增加了1.77倍，平均年增长3.30 km2（见表2）．

表3 病例组与对照组不同MTHFR基因型的Hcy水平Tab.3 Homocysteine levels in case group and control group±s，μmol/L

表3 病例组与对照组不同MTHFR基因型的Hcy水平Tab.3 Homocysteine levels in case group and control group±s，μmol/L

组别病例组对照组t值P值例数256 204 Hcy 15.6±6.5 9.4±4.5 11.588＜0.001各基因型的Hcy CC 14.9±5.2 9.2±4.2 9.944＜0.001 CT 15.1±5.8 9.6±4.4 6.378＜0.001 TT 22.8±11.7 11.2±6.8 2.673 0.011

2.2糖尿病脑梗死患者与非糖尿病脑梗死患者MTHFR基因C677T位点的基因分型表2显示，在68例糖尿病脑梗死患者中，CC型26例（38.2%），CT型25例（36.8%），TT型17例（25.0%），而在188例非糖尿病脑梗死患者中，CC型110例（58.5%），CT型64例（34.0%），TT型14例（7.4%），两组间分布差异具有统计学意义（χ2＝16.667，P＜0.001），其中糖尿病脑梗死组TT型的比例显著高于非糖尿病脑梗死组（χ2＝14.457，P＜ 0.001），CC型的比例则显著低于非糖尿病脑梗死组（χ2＝8.244，P＝0.004），两组间CT型所占比例差异无统计学意义（χ2＝0.163，P＝0.686）。糖尿病脑梗死组C等位基因频率显著低于非糖尿病脑梗死组（56.6%vs.75.5%），T等位基因则显著高于非糖尿病脑梗死组（43.4%vs.24.5%），差异具有统计学意义（χ2＝17.183，P＜ 0.001）。

表4 糖尿病脑梗死患者与非糖尿病脑梗死患者MTHFR基因型与Hcy水平相关性Tab.4 Correlation between MTHFR genotype and homocysteine levels in cerebral infarction patients with or without diabetes mellitus ±s，μmol/L

表4 糖尿病脑梗死患者与非糖尿病脑梗死患者MTHFR基因型与Hcy水平相关性Tab.4 Correlation between MTHFR genotype and homocysteine levels in cerebral infarction patients with or without diabetes mellitus ±s，μmol/L

组别糖尿病脑梗死组非糖尿病脑梗死组t值P值例数68 188 Hcy 14.5±5.0 16.0±6.9 1.578 0.116各基因型的Hcy CC 14.3±5.5 15.1±5.1 0.709 0.480 CT 14.4±4.5 14.7±5.7 0.262 0.793 TT 16.3±4.3 26.1±13.0 2.929 0.007

3 讨论

(2)从混合式教学在中小学领域研究文献的关键词可视化分析可以看出，研究的热门关键词为“混合式学习”、“混合式培训”、“中小学教师”、“教学设计”、“混合式教学”等，但是词与词之间的结构不是很紧密，词之间的关联性也不够，形成的紧密度也不高。

本研究对脑梗死患者及健康体检者的MTHFR基因C677T位点多态性进行分析发现，两组均为CC型所占比例最高，TT型最低，与文献［8-9］报道的以CT型比例最高不一致，可能与研究所纳入人群的遗传背景不一致有关，提示MTHFR基因多态性有着明显的地域差别［10-11］。对病例组和对照组人群MTHFR基因多态性比较结果显示，两组多态性分布存在显著差异，其中病例组TT型比例显著升高，CC型比例则显著降低，