热休克蛋白90α通过增强钙库操作性钙离子内流活性促进肝癌细胞转移

梁永红 冯超 周忠信

南方医科大学第三附属医院介入血管外科（广州 510630）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是我国较为常见的恶性肿瘤［1-2］。因肝癌细胞具有很强的侵袭与转移能力，很多肝癌被发现时已经发生转移，严重影响患者的预后［3-4］。因此，进一步阐明肝癌细胞侵袭与转移的机制，是肝癌防治的热点。钙库依耐性Ca2+内流（store-operated Ca2+entry，SOCE）是细胞外钙内流的主要通道，既往的研究发现抑制SOCE可减少肝癌细胞的侵袭与转移［5-6］。热休克蛋白 90（heat shock protein 90，Hsp90）是细胞内调控蛋白折叠、稳定等的重要蛋白，分为Hsp90α、Hsp90β、Grp94、TRAP1四种亚型［7-8］。其分泌到细胞外的 Hsp90α（extracellular Hsp90α，eHsp90α）被证实与肿瘤的侵袭与转移有关［9-10］，但其在肝癌转移中的作用和机制目前尚未见报道，是否可以调控SOCE也未有报道。因此，本研究皆指着探讨eHsp90α对肝癌细胞转移的影响，并探讨其中的机制。

1 材料与方法

1.1材料50 kDa超滤管（Merck公司，爱尔兰），人重组 Hsp90α（hrHsp90α）（StressMarq公司，英国），Transwell小室（Corning公司，美国），Fluo-4（同仁公司，日本），Hsp90α兔来源多克隆一抗（Abcam公司，美国），STIM1兔来源多克隆一抗（sigma公司，美国），STIM1鼠来源多克隆一抗（abcam公司，美国），ORAI1兔来源多克隆一抗（sigma公司，美国），β-actin鼠来源单克隆一抗（CST公司，美国），抗兔或鼠HRP标记二抗（中杉金桥，北京），抗兔或鼠荧光标记二抗（life，美国），高糖型DMEM、胎牛血清（Gibco公司，美国），胰蛋白酶（吉诺公司，中国），Lipofectamine®2000 Reagent（invitrogen，美国）。

1.2方法

1.2.1细胞培养正常肝细胞系LO-2和肝癌细胞系 HepG2、HL-7702、SNU-449、MHCC87H 和 HCCLM3由南方医科大学第三附属医院实验室保留细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在5%CO2的37℃孵箱中培养。

1.2.2细胞上清浓缩5 mL预冷的PBS加入超滤管，4℃、1 000 g/min、5 min离心以激活超滤管。弃超滤管中PBS，加入收集的上清液。4℃、5 000 g/min，离心时间视情况而定，至上室液体量为100～200 μL时。弃超滤出的液体，加入1 mL的预冷的PBS，用移液枪进行仔细吹打，由上而下，反复吹打5 min，再加入预冷的PBS定容到5 mL。同样的条件下进行离心。如此用PBS置换2次。最后一次超滤至液体剩余50 μL以下。最后用移液枪进行仔细吹打，由上而下，反复吹打5 min，回收液体，加入预冷的PBS定容至50 μL。再加入5 × Loading buffer 12.5 μL，放入沸水中，震荡煮沸10 min。样品冻-20℃，后续Western blot检测Hsp90α。

1.2.3小干扰RNA转染si-STIM1和对照si-NC小干扰RNA转染由上海吉玛生物公司合成。si-STIM1干扰系列：AGGTGGAGGTGCAATATTA，si-NC干扰系列：AATTCTCCGAACGTGTCACGT。转染步骤按Lipofectamine®2000 Reagent说明进行。转染48 h后，Western blot检测效率。

1.2.4Western blot检测提取全细胞胞浆蛋白，加入5×loading buffer，沸水煮10 min后-20℃保存。SDS-PAGE 胶分离蛋白（90 V，1.5 h），转膜（冰浴，90V，2 h），封闭（5% 脱脂奶粉，常温，2 h），STIM1、ORAI1、Hsp90α、β-actin一抗（1∶1 000）4 ℃过夜孵育，二抗（1∶5 000）常温1 h，TBST 5 min/次×3次洗膜后ECL显影。

1.2.5Transwell实验50 mg/L Matrigel 1∶5稀释，50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。使用前用上室加入100 μL无血清培养基DMEM 37℃湿化30 min。细胞消化后用无血清培养基DMEM制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL。吸取200 μL细胞悬液加入Transwell小室上室，下室加入含10%血清的DMEM 600 μL。18 h后取出小室，去除培养基，4%多聚甲醛固定10 min后，结晶紫染色2 h，显微镜下拍照。

1.2.6划痕实验先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5～1 cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。细胞种于6孔板中，细胞长至95%后饥饿24 h。用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37℃5%CO2培养箱，培养。按0和24 h取样，拍照。

1.2.7SOCE活性细胞1×105个种于confocal小皿中，处理好后37℃Hank液洗3次，加入Fluo-4（1∶200）37℃、避光染色30 min。D-Hank液洗3次，加入200 μL D-Hank液。Confocal检测荧光值变化。1.2.8免疫荧光细胞种于confocal皿中，处理好后TG室温刺激10 min。PBS洗一次，4%多聚甲醛室温固定10 min。PBS洗3次，加入0.25%曲拉通室温通透10 min。5%BSA封闭30 min，加入1∶100的SITM1（鼠来源）和ORAI1（兔来源）一抗，4℃孵育过夜。PBS洗3次，加入抗兔和抗鼠的荧光二抗（1∶200），室温避光孵育1 h。PBS避光洗3次，加入DAPI避光孵育5 min。PBS避光洗3次，confocal拍照。

1.3统计学方法应用SPSS 13.0统计学软件，采用One-way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法进行方差齐性检验，确定方差齐性且整体比较组间差异有统计学意义后进一步作多重比较，多重比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1eHsp90α促进肝癌细胞转移检测正常肝细胞系LO-2和肝癌细胞系HepG2、HL-7702、SNU-449、MHCC87H和HCCLM3培养基上清中eHsp90α的水平，结果显示肝癌细胞系中eHsp90α较正常肝细胞系显著增加；高度转移能力的MHCC87H和HCCLM3细胞中eHsp90α较低转移能力的HepG2、HL-7702和SNU-449显著升高（图1A）。同时，运用hrHsp90α刺激低转移能力的HepG2，发现其可以明显促进HepG2转移（图1B、1C）。提示，eHsp90α有促进肝癌细胞转移的作用。

图1 eHsp90α对肝癌细胞转移的影响Fig.1 The effect of eHsp90α on hepatocellular carcinoma cells metastasis

2.2 SOCE调控肝癌细胞转移SOCE作为细胞外钙离子内流的主要方式，在很多肿瘤细胞中都有调节转移的作用。因此，通过检测肝癌细胞系SOCE的水平，发现高度转移能力的MHCC87H和HCCLM3细胞中SOCE的活性较低转移能力的HepG2、HL-7702和SNU-449显著升高（图2A）。同时也观察到，SOCE的关键蛋白STIM1标准在MHCC87H和HCCLM3细胞中的表达较HepG2、HL-7702和SNU-449显著升高，但ORAI1蛋白表达差异不大（图2B和2C）。进一步用SOCE抑制剂2-APB和SKF-98059（SKF）抑制SOCE的活性及钙离子拮抗剂EGTA（图2D），可以显著抑制MHCC87H的高转移能力（图2E）。由此提示，SOCE的活性影响肝癌细胞转移。

2.3 下调STIM1表达抑制肝癌细胞转移在高转移并高表达STIM1的MHCC87H细胞系中，下调STIM1表达后（图3A）可减少SOCE活性（图3B）、STIM1和ORAI1的相互作用（图3C）；同时也发现MHCC87H细胞的转移能力被显著抑制（图3D）。STIM1高表达可增加SOCE的活性，进而促进肝癌细胞转移。

2.4 STIM1在eHsp90α促进肝癌细胞转移中的作用hrHsp90α处理的HepG2细胞STIM1表达显著升高（图4A），SOCE活性（图4B）及STIM1和ORAI1的相互作用水平增加（图4C），细胞转移能力增强（图4D）；而通过siRNA抑制STIM1增高后（图4A），增加的SOCE活性（图4B）及STIM1和ORAI1的相互作用水平被抑制（图4C），增高的细胞转移能力也被抑制（图4D）。提示，eHsp90α通过上调STIM1表达促进肝癌细胞转移。

3 讨论

通过上述的研究发现肝癌细胞中eHsp90α较正常肝细胞显著增加，并且高度转移能力肝癌细胞中eHsp90α水平、STIM1蛋白表达和SOCE活性较低转移能力肝癌细胞显著升高。同时还发现eHsp90α通过增强SOCE活性促进肝癌细胞的转移。

Hsp90是细胞内参与蛋白折叠和稳定的重要蛋白，大量的研究证明Hsp90在肿瘤细胞中表达增加，参了肿瘤的发生发展［11-12］。但因Hsp90在细胞正常生理中有重要作用，通过抑制Hsp90的活性来治疗肿瘤的同时出现严重副作用［13-14］。而新近的研究发现，分泌到细胞外的Hsp90有Hsp90α和Hsp90β。DONG等［9］的研究报道显示，细胞外的Hsp90α（即eHsp90α）有促进肿瘤转移的作用。并且，eHsp90α在肿瘤细胞外大量存在，与肿瘤的转移和侵袭密切相关［9-10］。本研究发现，在肝癌细胞系中eHsp90α较正常肝细胞系显著增加；高转移能力的MHCC87H和HCCLM3细胞中eHsp90α较低转移能力的HepG2、HL-7702和SNU-449显著升高。并且，用hrHsp90α诱导低转移性的HepG2细胞可以增强其转移能力。由此提示，eHsp90α可促进肝癌细胞的转移。

图2 激活的SOCE促进肝癌细胞转移Fig.2 Activated SOCE promotes liver cancer cell metastasis

图3 STIM1在肝癌细胞转移中的作用Fig.3 The effect of STIM1 on hepatocellular carcinoma cells metastasis

图4 STIM1在eHsp90α促进肝癌细胞转移中的作用Fig.4 The role of STIM1 in eHsp90α promoting hepatoma cell metastasis

SOCE的细胞外钙内流到细胞内的主要途径，在乳腺癌［15-16］、肺癌［17］、骨肉瘤［18］、肝癌［19］等肿瘤中均证实SOCE参与肿瘤细胞的转移和侵袭。通过对比低转移能力的HepG2、HL-7702、SNU-449细胞和高转移能力的MHCC87H、HCCLM3细胞的SOCE活性，本研究发现高转移能力的MHCC87H、HCCLM3细胞的SOCE活性显著高于低转移能力的 HepG2、HL-7702、SNU-449细胞。并且，抑制SOCE的活性可以抑制MHCC87H的转移能力。

SOCE主要由内质网上的STIM1蛋白激活细胞膜上的钙离子通道ORAI1，诱导外钙内流［20］。在高转移能力的MHCC87H、HCCLM3细胞中，STIM1蛋白的表达较低转移能力的HepG2、HL-7702、SNU-449细胞明显增加，但高低转移能力的肝癌细胞系中ORAI1蛋白表达没有差异。SAINT［21］和吴冰［22］等也均发现STIM1蛋白高表达可促进肿瘤转移。本研究进一步发现，敲低MHCC87H细胞STIM1蛋白表达后，其转移能力明显减弱。说明肝癌细胞中STIM1蛋白表达的差异导致SOCE活性的不同，进而影响肝癌细胞转移能力。本研究也发现，在eHsp90α诱导的HepG2细胞中，其SOCE活性显著增强，STIM1蛋白表达增多；但敲低增加的STIM1蛋白，eHsp90α诱导的HepG2细胞转移能力增加的作用被抑制。

综上所述，肝癌细胞通过大量分泌eHsp90α，诱导STIM1蛋白表达，增加SOCE活性，促进肝癌细胞的转移。这对进一步了解肝癌细胞转移的机制有一定的帮助。但eHsp90α是如何促进STIM1蛋白表达及SOCE激活后是如何促进肝癌细胞转移的还需要进一步研究。