miR-760调节integrin β3抑制非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的作用

王聪 黄幼生 蔡仁桑

1海口市第三人民医院呼吸内科（海口 570000）；2海南医学院第一附属医院病理科（海口 570102）

肺癌作为全世界最常见、发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其死亡率更是达到49.60/10万人，位于恶性肿瘤首位［1］。而非小细胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer，NSCLC）作为肺癌最常见的组织学类型，约占肺癌总数的80%以上，相对于其他种类的肺癌，其增殖、迁移等相对较快，约75%的患者发现时已处于中晚期，其5年生存率较低［2］。MicroRNA（miRNA）是长约 22 nt的非编码RNA，能与目标靶基因特异性结合，介导生物信号的调节。当前研究已表明，miRNA不仅参与调控了细胞分化、增殖、迁移以及存活等过程，而且还与糖尿病、心衰以及癌症在内的诸多病理过程有关［3-4］。近些年的研究发现，miR-760在胃癌、乳腺癌、直肠癌等多种癌症中呈低水平表达［5-9］，提示miR-760可能在癌症的发生发展中具有重要作用，但miR-760是否能作为抑癌基因在NSCLC增殖、迁移等过程发挥作用尚不清楚，仍需要进一步的研究。因此，本课题旨在阐明miR-760在NSCLC增殖、迁移和侵袭中的作用及其具体机制，为NSCLC的治疗及研究提供新的理论依据及思路。

1 材料与方法

1.1主要试剂及细胞株人肺腺癌细胞系A549细胞源自美国模式菌种收集中心（ATCC），miR-760 mimics、miRNA inhibitors、miRNA mimics control和miRNA inhibitors control均由广州锐博科技有限公司构建。抗体integrin β3、cyclin D1、GAPDH均来自cell signaling公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体来自北京康普森生物技术有限公司，miRNA提取试剂盒来自天根生化科技（北京）有限公司，Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR®Kit试剂盒来自宝日医生物技术（北京）有限公司，MTT检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，Cy-QUANT检测试剂盒购自sigma公司；RPMI 1640、双抗来自美国Gibco公司，FBS来自中国四季青公司，其他分析纯试剂均为国产。

1.2肺癌A549细胞培养及miR-760转染复苏A549 细胞，置于10%FBS+RPMI1640、5%CO2、37℃贴壁培养，隔天换液，当细胞长至培养皿80%时，消化传代。选取对数生长期的细胞，然后进行分组。转染细胞（对照组）：加入相应体积PBS；A549-mimics control组（miRNA过表达对照组）：加入miRNA mimics control，转染浓度50 nmoL；A549-inhibitor control组（miRNA抑制对照组）：加入miRNA inhibitors control，转染浓度 100 nmol；A549-760（+）组（miR-760过表达组）：加入miR-760 mimics，转染浓度50 nmoL；A549-760（-）组（miR-760抑制组）：加入miRNA inhibitors，转染浓度100 nmoL，加入相应转染试剂后，按照转染试剂盒使用说明进行转染24 h，PBS洗涤，换新培养基培养。

1.3MTT细胞活力与CyQUANT细胞增殖检测MTT细胞活力检测：取对数生长期的细胞按照5×103cell/孔种植于96孔板中，每组设置复孔8个，共铺设5板。置于5%CO2、37 ℃培养12 h，加入相应miRNA，转染24 h，然后换液（此时即为0 h）。继续培养0、24、48、72、96 h，然后吸弃培养液，加入新培养液100 μL和5 mg/mL的MTT溶液 20 μL，孵育4 h，吸弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡孵育10 min。酶联免疫检测仪492 nm测定光吸收值。CyQUANT细胞增殖检测：与MTT细胞活力检测前面步骤相同，细胞分组培养0、24、48、72、96 h后，吸弃培养液，将培养板于70℃冷冻1 h以上。然后于室温化冻，然后加入200 μL的CYQUANTGR染液/细胞裂解液，涡旋混匀，避光室温孵育5 min，酶标仪检测荧光值（激发光485 nm，发射光535 nm）。

1.4细胞划痕实验6孔板背面用marker笔每隔1 cm划水平线，每孔划线至少3条。将control，A549-760（+），A549-760（-），A549-mimics control，A549-inhibitor control各组细胞以5×104cell/孔密度种植，当细胞长至70%时，吸弃培养液。使用200 μL枪头垂直于背面水平线在6孔板内表面划痕，每孔划5条，PBS漂洗，加入2%FBS的RPMI 1640培养液，并于划痕与横线交叉处拍照记录。然后继续培养72 h后，以同样放大倍数拍照，比较各组细胞迁移率。

1.5Matrigel transwell小室细胞侵袭实验预冷移液枪头吸取40 μL的 Matrigel，均匀加入Transwell小室内，37℃恒温培养箱孵育1 h。然后将各组细胞以2×105cell/孔种植于小室内，然后加入无血清RPMI 1640培养液150 μL。在孔板内加入含 20%FBS的RPMI 1640培养液 600 μL，之后将Transwell小室放入板内培养。48 h之后取出小室，轻轻擦去Matrigel胶及胶上未迁出细胞，PBS洗涤，结晶紫染色，随机选取4个视野计数细胞。

1.6miRNA quantitative real-time PCR测定通过miRNA提取试剂盒提取组织及细胞miRNA，按照Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR®Kit试剂盒的使用说明书进行逆转录及定量分析。结果通过2-△△CT相对定量法进行分析（miR-760 forward，5′-TAT TGCTTAAGAATACGCGTAG-3′and reverse 5′-AAC TCCAGCAGGACCATGTGAT-3′）。

1.7Western blot法检测integrin β3、cyclin D1蛋白表达提取蛋白样品后，BCA法测定蛋白浓度，按照30 μg/每通道上样量，130 V进行SDS-PEGE电泳，然后恒流转膜。转膜后将其放置于脱脂奶粉（50 g/L）溶液中封闭2 h。然后一抗（1∶1 000 integrin β3和cyclin D1）4℃孵育过夜。TBST洗涤，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST洗涤，ECL发光。

1.8统计学方法本论文所有数据以±s表示，每组数据均进行3次以上重复，使用SPSS 18.0统计软件对实验数据进行汇总分析，数据比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1qRT-PCR法检测miR-760表达差异qRTPCR检测miR-760基因在NSCLC细胞系（A549，SPC-A1，H1299，H23）及癌旁组织中的表达差异，结果显示：miR-760 mRNA在NSCLC细胞系中的表达明显低于癌旁组织（图1）。

2.2miRNA转染A549细胞鉴定与Control组和A549-mimics control相比，A549-760（+）组（过表达组）细胞miR-760的表达较对照组明显增加；与control组和A549-inhibitor control相比，而A549-760（-）组（抑制组）miR-760表达较对照组明显降低（P ＜0.05）；其次与 control组细胞相比，A549-mimics control和A549-inhibitor control组细胞miR-760 mRNA表达量差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

图1 qRT-PCR检测miR-760基因在NSCLC细胞系及癌旁组织中的表达Fig.1 Expression of miR-760 in the NSCLC cell lines and the adjacent normal tissues was detected by qRT-PCR

图2 qRT-PCR检测miR-760表达Fig.2 Expression of miR-760 was measured by qRT-PCR

2.3 miR-760对细胞活力及增殖能力的影响MTT和CyQUANT试剂盒检测各组细胞在96 h内的细胞活力与增殖能力。结果显示：A549-miR-760（-）组在培养48 h后，其细胞活力及增值率较对照组明显增高（P＜0.05），而A549-760（+）组在培养72 h后呈现统计学差异，其细胞活力降低（P＜0.05），增殖减慢（P＜0.05）（图3）。

图3 MTT和CyQUANT检测细胞活力及增殖Fig.3 MTT and CyQUANT assay for assessing cell metabolic activity and proliferation

2.4 miR-760对A549细胞侵袭能力的影响Matrigel-Transwell实验检测miR-760对A549细胞体外侵袭能力的影响，结果表明：A549-760（+）组穿过滤膜的细胞数量与Control组和A549-mimics Control相比，显著减少（P ＜ 0.05），而 A549-760（-）组与control组和A549-inhibitor control相比穿过滤膜的细胞数量则明显增加（P＜0.05）；A549-mimics Control和A549-inhibitor control组穿过滤膜的细胞数量与对照组相比差异无统计学意义（图4）。

2.5 miR-760对肺癌A549细胞迁移能力的影响细胞划痕实验以检测miR-760对A549迁移能力的影响，结果显示：同Control组相比，A549-760（+）组细胞迁移能力明显减弱，而A549-760（-）组迁移能力却显著增强A549-mimics Control和A549-inhibitor control组细胞迁移能力与对照组相比无明显变化（图5）。

2.6 miR-760对integrin β3和cyclin D1的影响检测integrin β3和cyclin D1基因在NSCLC细胞系（A549，SPC-A1，H1299，H23）及癌旁组织中的表达差异，结果显示：integrin β3和cyclin D1在NSCLC细胞系中的表达明显高于癌旁组织，结果差异有统计学意义（P ＜ 0.005）。而且，A549-760（+）细胞integrin β3和cyclin D1蛋白的表达最低，A549-760（-）细胞integrin β3和cyclin D1蛋白的表达量最高，差异有统计学意义（图6，P＜0.005）。

3 讨论

研究发现，当肺癌患者其癌细胞未发生转移时，5年生存率可达50%，但是如若患者癌细胞已经局部浸润或者发生区域淋巴结转移，其5年生存率会直接下降达到20%，而发生癌症远处转移的患者其5年生存率更是低至4%［10-11］，由此可见细胞的快速侵袭、增殖和迁移效率是影响肺癌患者预后效果，甚至进一步导致其死亡的主要因素［12］。而NSCLC作为肺癌的主要类型，因增殖转移较快，多数患者在就诊时其癌细胞就已浸润周围的正常组织。因此，找寻并探索抑制NSCLC侵袭、增殖和迁移的方法与机制，是目前NSCLC的临床治疗急需解决的问题。

图5 过表达miR-760抑制细胞迁移Fig.5 miR-760 overexpression suppressed the cell migration

图6 过表达miR-760抑制integrin β3和cyclin D1的表达Fig.6 Overexpression of miR-760 inhibited the integrin β3 and cyclin D1 expression

miRNA被发现可以与靶基因mRNA进行不同程度的特异性结合，促使靶基因的抑制与降解，参与调控了多种生物学过程，如组织分化、衰老死亡和肿瘤发生发展等［13］。而且目前已有研究发现：miRNA在多种癌症中存在差异，并具有抑癌基因作用。miR-760相关研究发现乳腺癌中过表达miR-760可以抑制乳腺癌的增殖和迁移［7］。除此之外，KIM等［9］研究表明结肠直肠癌患者血液miR-760含量明显低于健康患者。但miR-760在肺癌，特别是在NSCLC中增殖、迁移和侵袭中的作用尚不清楚。基于此，笔者探索了miR-760在NSCLC增殖、迁移和侵袭中的作用及其调控机制，为其的临床治疗提供新思路。

本研究对NSCLC细胞系及癌旁组织中的miR-760基因表达进行差异检测，发现miR-760的表达在NSCLC细胞系中显著低于癌旁组织，提示miR-760可能在肺癌的发生发展中起重要的负性调节作用。笔者在体外建立过表达和低表达miR-760的A549细胞，进而明确miR-760基因对肺癌细胞增殖迁移等生物学能力的影响。采用MTT、CyQUANT、细胞迁移和侵袭检测首先明确了miR-760在A549细胞增殖、迁移及侵袭作用。结果显示，miR-760负性调节了A549细胞的增殖、迁移及侵袭，过表达miR-760将抑制A549细胞其增殖、迁移及侵袭能力，抑制miR-760表达则增强A549细胞增殖、迁移及侵袭能力。Integrin β3作为一类介导细胞外基质与细胞内微环境物理连接和信息连接的跨膜受体，控制着细胞的粘附、运动、迁移、增殖和凋亡等基本细胞生物学功能，与肿瘤等重大疾病发生发展密切相关。本研究结果显示：过表达miR-760，能够A549细胞抑制Integrin β3表达及周期蛋白Cyclin D1表达；而抑制miR-760表达则上调Integrin β3及周期蛋白Cyclin D1。

总之，本研究证明miR-760可能是通过抑制integrin β3表达，对NSCLC的增殖、迁移及侵袭具有负性调节作用，这将为肺癌患者的临床治疗提供了新的靶点与思路。