microRNA-181b-3p对人胆囊癌细胞侵袭能力的影响

何政 吴慧 郑军

三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院肝胆胰外科（湖北宜昌443002）

胆囊癌（gallbladder cancer，GBC）是指发生于胆囊及胆囊管的恶性肿瘤，其发病率在消化道肿瘤中位居第六，由于其起病隐匿，易发生转移，预后极差，患者中位生存期仅有6个月［1］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长约17～25个核苷酸的短链非编码RNA，通过与mRNA上3′端非翻译区结合，阻止mRNA翻译或导致其降解，以此来调控相应蛋白的表达［2-3］。其在免疫调节、细胞分化、肿瘤形成等过程中均发挥着重要的作用［4-5］。目前，miRNA在肿瘤中的作用不尽相同，一些miRNA直接作用于具有促凋亡或抗增殖作用的基因转录本而表现出促进肿瘤进展的作用，相反，表现为抑制肿瘤作用的miRNA则被证实能够抑制控制细胞分化或凋亡的基因的表达［6］。在胆囊癌中，miR-155、miR-20a和miR-182被鉴定为是促进肿瘤进展的调控因子［7-9］。而另一些miRNA如miR-135a、miR-26a以及miR-146b-5p则表现为抑制胆囊癌的发展［10-12］。上皮间充质转化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）被认为是肿瘤发生侵袭转移的重要原因［13-14］。有研究表明在乳腺癌中，miR-181b-3p能促进这一过程，并参与肿瘤的侵袭转移［15］。因此研究miR-181b-3p在胆囊癌中的表达及与EMT的关系至关重要。本研究通过体外细胞学实验分析miR-181b-3p对于胆囊癌细胞侵袭和迁移能力的影响，揭示miR-181b-3p在胆囊癌细胞侵袭转移中的作用。

1 材料与方法

1.1组织标本、细胞株来源和制剂人胆囊癌细胞株GBC-SD由华中科技大学附属同济医院胆胰外科实验室馈赠；人胆囊癌组织及正常组织来自三峡大学第一临床医学院肝胆胰外科病区8例胆囊癌患者。所有患者均签署由医院伦理委员会批准的患者知情同意书，符合医学伦理学规定。所有标本均在离体后30 min内置于液氮罐冻存，标本均经过病理学切片确诊。DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；miR-181b-3p的模拟物（mimic，正义链为：CUCACUGAACAAUGAAUGCAA）、抑制物（inhibitor，序列为GAGUGACUUGUUACUUACGUU）及对照序列（NC，UUUGUACUACACAAAAGUACUG）由广州锐博生物科技有限公司负责构建；PCR相关SYBR Premix试剂购自Takara公司；Trizol、Lipofectamine2000购自美国赛默飞公司；Transwell小室及六孔板购自美国Corning公司；Vimentin、E-cadherin、GAPDH抗体购自美国CST公司；Matrigel基质胶购于美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养人胆囊癌细胞系GBC-SD在含10%胎牛血清的DMEM培养基、37℃、5%CO2的条件下，于细胞培养箱中培养，根据细胞生长情况每2～3天更换新鲜培养基或进行细胞传代培养。

1.2.2PCR检测正常及胆囊癌组织中RNA表达量充分剪碎组织，每1 mL Trizol加入200 μL，充分震荡后离心，取上层液相于新的Ep管并加入1 mL异丙醇，离心后弃上清，得到的产物加入1 mL 75%乙醇进行洗涤，离心后得到RNA自然晾干，用无酶水溶解，得到正常及胆囊癌组织RNA。按照逆转录试剂盒说明书配置逆转录体系（茎环法），用PCR仪按如下条件反应：预变性，95℃，20 s；变性，95 ℃，10 s；退火，60 ℃，20 s；延伸，70 ℃，10 s；40个循环，每个样本的目的基因与内参基因U6的循环阈值的差异为△Ct，处理组与对照组△Ct的差异值为△△Ct。以2-△△Ct来表示基因的相对表达量，检测miR-181b-3p在正常及胆囊癌组织中的表达情况。

1.2.3miR-181b-3p模拟物及抑制物的转染选取处于对数生长期的GBC-SD细胞制备细胞悬液，以密度3.5×105个/mL接种于6 cm培养皿中，待细胞生长至70%左右时，分别将模拟物、抑制物及对照转染入每个皿中，分别设为miR-181b-3p过表达组、低表达组及对照组。24 h时换液，48 h时提取RNA，通过PCR验证转染效率。

1.2.4Trasnwell小室侵袭实验Matrigel基质胶用无血清培养基按1∶8稀释，加入小室上室面，于37℃30 min水化基底膜。制备转染48 h后的GBCSD细胞悬液（用不含血清的培养基重悬），密度为2× 105个/mL，每个小室中加入200 μL，下室加入含10%血清的培养基600 μL，置于培养箱中培养24～36 h后用PBS洗两遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，用棉签擦去上室面细胞，显微镜拍照并统计。

1.2.5波形蛋白、E-钙黏蛋白表达测定依据蛋白提取试剂盒说明书提取转染48～72 h后的GBCSD细胞蛋白，检测蛋白浓度并计算上样量，依次进行电泳、转膜、封闭、一抗4℃孵育过夜、二抗37℃孵育2 h及化学发光等步骤，图片采用Image Lab软件分析灰度值。

1.3统计学方法采用SPSS 23.0对实验数据进行分析、整理。计量资料采用均数±标准差表示，方差检验齐性，两组比较采用t检验，Transwell实验结果3组比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1miR-181b-3p在胆囊癌组织及癌旁组织中的表达PCR结果显示，8例胆囊癌组织中miR-181b-3p相对表达量（9.22±5.74）明显高于对应的正常组织（2.54±1.27），差异有统计学意义（t=3.213，P=0.006 3，图1）。

图1 8例胆囊癌组织及正常组织中miR-181b-3p相对表达量Fig.1 Relative expression of miR-181b-3p in gallbladder carcinoma and paired normal tissues（8 cases）

2.2 细胞转染效率检测将构建好的miR-181b-3p模拟物、抑制物及对照分别转染入GBC-SD细胞系中，48 h后提取RNA并用PCR进行验证，结果显示过表达组相对表达量（423.10±77.64）明显高于对照组的1（t=9.432，P=0.011 1；图2A）；低表达组相对表达量（0.32±0.05）明显低于对照组的1（t=9.416，P=0.002 0；图2B），证实其模拟物可以有效增加GBC-SD细胞miR-181b-3p的表达，而抑制物可以有效减低其表达。

图2 转染miR-181b-3p模拟物、抑制物及对照组转染后GBC-SD细胞中miR-181b-3p的相对表达量Fig.2 Relative expression of miR-181b-3p in GBC-SD cells when transfected with miR-181b-3p mimic，inhibitor and control

2.3 Transwell实验检测miR-181b-3p对GBC-SD侵袭能力的影响Transwell实验结果表明，在胆囊癌细胞系GBC-SD中，过表达组侵袭转移的细胞数量为（811.40±179.53）个，明显高于对照组的（231.00 ± 61.22）个（LSD-t=8.357，P=0.000 9）；而低表达组侵袭转移的细胞数量为（28.80±13.81）个，明显低于对照组的（231.00±61.22）个（LSD-t=2.912，P=0.001 2；图3）。

图3 miR-181b-3p对胆囊癌细胞侵袭转移能力的影响Fig.3 Effect of miR-181b-3p on invasion of GBC-SD cells（× 100）

2.4 Western blot检测波形蛋白、E-钙黏蛋白表达对转染了miR-181b-3p模拟物、抑制物及对照的GBC-SD细胞进行Western blot检测，结果显示相比于对照组过表达组波形蛋白表达增多，E-钙黏蛋白表达减少；而低表达组波形蛋白表达减少；E-钙黏蛋白表达增多（图4）。

2.5 组织中E-钙黏蛋白与miR-181b-3p表达的相关关系通过对组织中miR-181b-3p与E-钙黏蛋白表达量的检测发现，E-钙黏蛋白的表达与组织中miR-181b-3p的含量呈负相关关系（图5）。

图4 miR-181b-3p对GBC-SD细胞中波形蛋白、E-钙黏蛋白表达的影响Fig.4 Effect of miR-181b-3p on the expression of vimentin and E-cadherin in GBC-SD cells

图5 8例胆囊癌组织中E-钙黏蛋白表达与miR-181b-3p含量的相关关系Fig.5 Correlation between expression of E-cadherin and miR-181b-3p in gallbladder carcinoma tissues（8 cases）

3 讨论

胆囊癌是一类恶性程度极高的肿瘤，其进展隐匿而迅速，易发生侵袭转移，使得大部分胆囊癌在发现时就已属于晚期，5年总生存率仅为5%［16］。研究认为，miRNA在癌症的侵袭转移过程中起着重要作用［17］。miR-181b-3p定位于人类基因组1号染色体，大小为21 bp，基因序列为CUCACUGAACAAUGAAUGCAA［18］。近年来的研究发现，miR-181家族与白血病、肝癌、前列腺癌、宫颈癌等多种癌症的发生发展有关［19-20］。在乳腺癌中，miR-181b-3p可能促进了乳腺癌细胞的上皮-间充质转化，进而增强了其侵袭转移能力［15］。E-钙黏蛋白（E-cadherin）等细胞黏附分子表达的减少以及细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白（Vimentin）为主的细胞骨架是上皮-间充质转化过程的显著特征［21-23］。本研究通过检测胆囊癌组织中miR-181b-3p、E-钙黏蛋白、波形蛋白的表达量，着重探究miR-181b-3p与胆囊癌细胞的上皮-间充质转化之间的关系及其在胆囊癌侵袭转移过程中的作用。

本研究通过PCR检测正常胆囊组织与胆囊癌组织中的miR-181b-3p表达情况，首次阐明了胆囊癌组织中的miR-181b-3p含量明显高于正常组织。通过构建miR-181b-3p模拟物及抑制物，本研究实现了胆囊癌细胞中miR-181b-3p的上调与下调，并且通过Transwell实验，进一步证明过表达miR-181b-3p能显著提高胆囊癌细胞的侵袭转移能力，而下调miR-181b-3p降低了其侵袭转移能力。这些结果提示miR-181b-3p在胆囊癌中扮演了促进侵袭转移的角色。在LIU等［24］的研究中，miR-181b直接作用于HMGB1并且是一个抑制非小细胞肺癌侵袭的调节因子。ZHOU等［25］也发现miR-181b能够抑制神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭。虽然上述研究与本研究结果不同，但是考虑到肿瘤拥有各自独特的性质，其同一个因子也并非单一调控下游靶基因，因此miRNA对肿瘤侵袭的调控可能会有不同的结果。本研究还证实miR-181b-3p能升高波形蛋白的表达，同时减少E-钙黏蛋白的表达。通过进一步研究胆囊癌组织中miR-181b-3p与E-钙黏蛋白的表达情况，发现E-钙黏蛋白的表达与组织中miR-181b-3p的含量呈负相关关系。这些结果有力证实，miR-181b-3p促进了胆囊癌细胞的上皮-间充质转化，进而增强了其侵袭转移能力。

综上所述，EMT是胆囊癌细胞发生侵袭转移的重要方式。miR-181b-3p在胆囊癌组织中高表达，其通过促进胆囊癌细胞的上皮-间充质转化而促进其侵袭转移。因此干预miR-181b-3p的表达并通过其调控EMT可对肿瘤进展过程产生关键性影响，进而可能提高患者生存率。miR-181b-3p在胆囊癌的恶性进展中扮演着的重要调控角色，有望成为胆囊癌诊治的靶点之一。遗憾的是，miRNA靶向降解目标基因的RNA从而发挥转录后调控的功能，而本研究尚未进行miR-181b-3p靶基因的寻找和其功能的鉴定。miR-181b-3p在调节胆囊癌侵袭发生的机制仍有待进一步阐明。