COX-2、MMP-9和VEGF在子宫腺肌病异位内膜间质细胞中的表达及其意义

李灿宇 刘欢欢 王婷婷 陈增鑫 申爱荣 封全灵

郑州大学第三附属医院妇科（郑州 450052）

子宫腺肌病严重危害妇女健康，但仍缺乏有效的临床治疗策略［1］。子宫腺肌病可能具有较为独特的分子病理学特征［2］，了解其发病机制对寻找有效治疗策略有重要意义。本课题组前期研究表明COX-2、VEGF、MMP-9表达下降与子宫腺肌病间质细胞凋亡有关［3］。为进一步探讨三者与子宫腺肌病发生发展的关系，本研究通过免疫组化研究了子宫腺肌病异位内膜组织中COX-2、VEGF、MMP-9的蛋白表达及相关性，通过分离间质细胞，实时定量PCR（real-time PCR）和western blot方法检测了子宫腺肌病组织间质细胞中COX-2、VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白表达，并观察了间质细胞中COX-2基因沉默对VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白表达的影响，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料标本来自2013年12月至2015年12月在郑州大学第三附属医院妇科行腹腔镜或开腹手术的子宫腺肌病患者，收集在位、异位内膜新鲜组织各30例，选取同期正常内膜新鲜组织10例（排除子宫腺肌病、内膜异位症及其他妇科良性疾病）作为正常对照，另外收集40例异位内膜组织石蜡包埋标本。全组病例年龄25～54岁（各组间年龄差异无统计学意义），术前3个月无激素使用史，诊断经腹腔镜、病理诊断证实。手术室中获取无菌标本后立即置于无菌4℃预冷的含有青、链霉素的DMEM/F-12（FD）培养液，1 h内送至实验室在生物安全柜中进行培养。本研究经郑州大学第三附属医院伦理委员会审议同意，所有标本采集均经患者知情同意。兔抗人多克隆抗体COX-2（12375-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫组化检测兔抗人多克隆抗体COX-2（12375-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司。兔抗人单克隆抗体MMP-9（ZA-0562）和兔抗人多克隆抗体VEGF（ZA-0509）购自北京中杉金桥生物科技有限公司。所有组织标本经石蜡包埋，4 μm连续切片，用苏木素-伊红（HE）染色观察病理变化，用Envision免疫组化二步法检测蛋白表达情况。严格按照试剂盒说明书进行操作，阳性对照切片由试剂公司提供，染色结果阳性。阴性对照用PBS缓冲液代替一抗，染色结果阴性。

1.2.2免疫组化结果判定方法每张切片选10个高倍视野（400倍），根据染色程度及染色范围来计算评分。按阳性细胞所占百分比评分：无阳性细胞者为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；按染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以阳性细胞所占百分比与染色强度评分的乘积为总评分，总评分≤6为低表达，总评分＞6为高表达。

1.2.3实时荧光定量PCR检测间质细胞原代培养与鉴定，siRNA转染复合物制备和瞬时转染方法见前期研究［3］。提取各组细胞RNA，反转录后进行实时定量PCR扩增。反应体系为20 μL，包含SYBR Green Master（ROX）试剂10 μL、上下游引物各 0.6 μL、模板 cDNA 1.0 μL 和 RNase-Free Water 7.8 μL；扩增程序为 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，共40个循环。生成定量标准曲线图，计算机分析Ct值。计算方法：目的基因的相对定量值 =2-△△Ct。抑制率（%）=（1-干扰组COX-2 mRNA相对表达量/空白对照组COX-2 mRNA相对表达量）×100%。

1.2.4Western blot检测收集转染前和转染48 h后的细胞提取总蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移至硝酸纤维素膜；用1×PBS配制的5%脱脂牛奶室温封闭2 h，弃去牛奶，加入一抗兔抗人COX-2、VEGF、MMP-9和鼠抗人β-actin抗体（cell signal technology），于4℃下孵育过夜；PBST洗涤3次，用HRP标记的抗鼠的二抗于室温孵育2 h后检测。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0统计软件包对所得数据进行处理。所有计量资料以均数±标准差表示，多样本均数比较用单因素方差分析（ANOVA），多样本均数间的两两比较采用最小意义差异法（LSD-t检验）或Tamhane′s T2法，两独立样本均数之间的比较采用t检验。用χ2检验分析COX-2、MMP-9和VEGF高表达情况，采用Pearson相关性检验进行相关性分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1子宫腺肌病异位内膜组织中COX-2、VEGF和MMP-9高表达及其相关性COX-2、VEGF和MMP-9蛋白主要在异位内膜腺体细胞和间质细胞胞浆中表达（图1），子宫腺肌病异位内膜组织中COX-2、VEGF和MMP-9蛋白高表达率分别为57.5%（23/40）、45.0%（18/40）和37.5%（15/40）。Pearson相关性分析显示COX-2和VEGF高表达呈显著正相关（r=0.676，P=0.000），COX-2和MMP-9高表达呈显著正相关（r=0.457，P=0.003），MMP-9和VEGF高表达呈显著正相关（r=0.441，P=0.004）。

2.2子宫腺肌病在位、异位内膜和正常子宫内膜间质细胞中COX-2、VEGF和MMP-9 mRNA的相对表达如表1所示，子宫腺肌病患者离体培养的在位、异位间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA的表达均明显高于正常对照组（P＜0.05），且异位间质细胞中的表达均显著高于对应在位内膜（P＜0.05）。

2.3子宫腺肌病在位、异位内膜和正常子宫内膜间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相对表达如表2所示，子宫腺肌病组患者离体培养的在位、异位间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相对表达均明显高于正常对照组（P＜0.05），且异位内膜间质细胞（ESC）mRNA和蛋白的表达均明显高于对应在位内膜（P＜0.05）。

图1 免疫组化检测COX-2、VEGF和MMP-9蛋白在异位内膜组织腺体和间质细胞中的表达（Envision二步法，箭头示间质细胞阳性表达）Fig.1 Expression of COX-2，VEGF and MMP-9 proteins in adenomyosis ectopic endometrium by immunohistochemistry（Envision staining，arrows show positive stromal cells）

表1 子宫腺肌病在位、异位内膜和正常对照组间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相对表达（n=10）Tab.1 RelativeexpressionofCOX-2，MMP-9andVEGFmRNA in adenomyosis and control stromal cells（n=10） ± s

表1 子宫腺肌病在位、异位内膜和正常对照组间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相对表达（n=10）Tab.1 RelativeexpressionofCOX-2，MMP-9andVEGFmRNA in adenomyosis and control stromal cells（n=10） ± s

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与对应在位内膜组比较，△P＜0.05

组别异位内膜组*△在位内膜组*正常对照组COX-2 3.460 7±0.312 2.193 3±0.599 1.467 0±1.280 VEGF 3.921 4±0.690 2.654 9±0.628 1.245 3±0.729 MMP-9 2.747 3±0.972 1.557 7±0.590 1.012 5±0.162

表2 子宫腺肌病和正常对照间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相对表达（n=10）Tab.2 RelativeexpressionofCOX-2，MMP-9andVEGFproteinin adenomyosis and control stromal cells（n=10） ± s

表2 子宫腺肌病和正常对照间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相对表达（n=10）Tab.2 RelativeexpressionofCOX-2，MMP-9andVEGFproteinin adenomyosis and control stromal cells（n=10） ± s

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与对应在位内膜组比较，△P＜0.05

组别异位内膜组*△在位内膜组*正常对照组0.795 6±0.012 0.694 4±0.016 0.245 3±0.016 0.885 5±0.018 0.782 8±0.015 0.122 6±0.008 0.818 8±0.007 0.712 4±0.129 0.074 0±0.009 COX-2VEGF MMP-9

2.4COX-2基因沉默后子宫腺肌病在位、异位内膜和正常子宫内膜间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA的相对表达沉默COX-2基因后，与阴性对照组和空白对照组相比，子宫腺肌病在位、异位内膜间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA的相对表达量均显著下降，阴性对照组和空白对照组相比差异无统计学意义（表3、4）。

表3 COX-2基因沉默后子宫腺肌病在位、异位间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相对表达（n=10）Tab.3 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF mRNA in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing（n=10） ± s

表3 COX-2基因沉默后子宫腺肌病在位、异位间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相对表达（n=10）Tab.3 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF mRNA in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing（n=10） ± s

注：与阴性组比较，*P＜0.05；与空白组比较，△P＜0.05，#P＞0.05

组别干扰组*△阴性组#空白组COX-2异位0.897 8±0.025 3.162 4±0.485 3.460 7±0.3120在位0.919 2±0.163 1.936 7±0.096 2.193 3±0.599 VEGF异位1.082 5±0.310 3.168 1±0.356 3.921 4±0.690在位1.442 3±0.223 2.432 9±0.467 2.654 9±0.628 MMP-9异位0.768 0±0.268 2.438 9±0.302 2.747 3±0.972在位0.791 2±0.173 1.648 9±0.351 1.557 7±0.590

表4 COX-2基因沉默后各组VEGF、MMP-9 mRNA表达的下降率Tab.4 Decrease rate of VEGF and MMP-9 mRNA in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s，%

表4 COX-2基因沉默后各组VEGF、MMP-9 mRNA表达的下降率Tab.4 Decrease rate of VEGF and MMP-9 mRNA in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s，%

注：与对应在位内膜组，*P＜0.05

组别子宫腺肌病异位内膜组*子宫腺肌病在位内膜组VEGF 71.80±9.25 42.15±17.69 MMP-9 70.79±8.30 41.50±27.48

2.5 COX-2基因沉默后子宫腺肌病在位、异位内膜和正常子宫内膜间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相对表达沉默COX-2基因后，与阴性对照组和空白对照组相比，子宫腺肌病在位、异位内膜间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相对表达量均显著下降，阴性对照组和空白对照组相比差异无统计学意义（图2，表5、6）。

图2 Westernblot检测COX-2基因沉默后AM各组及正常对照组ESC中COX-2、VEGF及MMP-9蛋白相对表达Fig.2 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF protein in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis and controls after COX-2 gene silencing detected by western-blot

表5 COX-2基因沉默后子宫腺肌病在位、异位间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相对表达Tab.5 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF protein in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing ± s

表5 COX-2基因沉默后子宫腺肌病在位、异位间质细胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相对表达Tab.5 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF protein in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing ± s

注：与阴性组比较，*P＜0.05；与空白组比较，△P＜0.05，#P＞0.05

组别干扰组*△阴性组#空白组COX-2异位0.453 6±0.014 0.785 3±0.009 0.795 6±0.012在位0.469 5±0.010 0.691 4±0.015 0.694 4±0.016 VEGF异位0.369 5±0.008 0.886 2±0.012 0.885 5±0.018在位0.495 2±0.015 0.780 8±0.015 0.782 8±0.015 MMP-9异位0.290 6±0.009 0.812 9±0.010 0.818 8±0..007在位0.387 5±0.007 0.706 0±0.013 0.712 4±0.129

表6 COX-2基因沉默后子宫腺肌病各组VEGF、MMP-9蛋白表达的下降率Tab.6 Decrease rate of VEGF and MMP-9 protein in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s，%

表6 COX-2基因沉默后子宫腺肌病各组VEGF、MMP-9蛋白表达的下降率Tab.6 Decrease rate of VEGF and MMP-9 protein in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s，%

注：与对应在位内膜组，*P＜0.05

组别异位内膜组*在位内膜组VEGF 58.25±1.53 36.69±3.01 MMP-9 64.50±1.16 45.59±1.75

3 讨论

子宫腺肌病是指子宫内膜腺体和间质细胞在子宫肌层弥漫性或局限性生长，引起痛经、月经过多和不孕不育，严重影响患者身心健康的一种疾病，其发病机制尚不清楚［4］。目前的研究认为AD发病的分子机制包括5个方面：炎性因子、细胞外基质酶、生长因子、性激素受体及神经血管生成因子［5］。子宫内膜的异位侵袭及血管生成是子宫内膜侵入肌层并生长发育的必备条件，新生血管的形成需要多种血管形成相关因子的协同作用，包括VEGF、COX-2、MMP及血管生成素（angiogenin，Ang）等［6］。其中COX-2、MMP和VEGF分别代表了AD发病机制中的炎性因子、细胞外基质及生长因子三个方面，研究其三者与AD的关系可以进一步探索AD的发生机制，为其靶向治疗提供理论基础。

COX-2为花生四烯酸合成酶的限速酶，可将花生四烯酸转变为PGE2，PGE2作为芳香化酶P450的诱导因子，可促进E2的合成，E2又可刺激COX-2的合成，故COX-2、PGE2、P450、E2形成了一个恶性循环［7］。在子宫内膜异位症小鼠模型中抑制COX-2可通过降低PGE2的表达水平，从而抑制VEGF表达影响血管生成［8］。这些研究提示COX-2可能是影响子宫内膜异位疾病发生、发展的重要因子。

VEGF作为最强的血管生成因子，其高水平表达与子宫腺肌病发生关系密切，其高表达的致病机制尚不清楚［9］。雌激素可通过诱导VEGF高表达及血管生成促进子宫腺肌病的发生［10］。MMP-9是一种重要的基质金属蛋白酶，其高表达与AD的发生密切相关［11］，多种信号通路可通过调节MMP-9参与子宫腺肌病的发生［12］。本研究通过免疫组化方法检测了子宫腺肌病异位内膜组织中COX-2、VEGF和MMP-9蛋白表达，结果显示三者在子宫腺肌病组织中均呈高表达，且存在显著正相关。结果提示COX-2可能与VEGF、MMP-9一起共同参与了子宫腺肌病的发生和异位侵袭。

子宫内膜上皮细胞的间质转化是子宫腺肌病发生的重要分子病理机制，间质细胞增殖和侵袭成为子宫腺肌病发生发展的重要因素［13-14］。子宫腺肌病的内膜异位的发生与肿瘤细胞的恶性侵袭行为类似，有研究表明，在肿瘤细胞中选择性抑制COX-2表达能显著改变VEGF和MMP-9表达，并抑制肿瘤发展［15］。本研究通过对间质细胞的分离和鉴定，检测了间质细胞中MMP-9、VEGF和COX-2的表达情况，结果显示三者在子宫腺肌病内膜间质细胞中的表达显著高于正常对照，尤其在异位内膜间质细胞中更为显著，结果提示三者表达上调可能在间质细胞侵袭中发挥重要作用。而当在子宫腺肌病间质细胞中沉默COX-2基因后，在位、异位内膜间质细胞中VEGF、MMP-9的表达显著下调，尤其在异位间质细胞中更为明显。这提示子宫腺肌病间质细胞中COX-2可能是VEGF、MMP-9通路的上游因子，COX-2可能通过对VEGF、MMP-9表达调节参与了该疾病的发生，针对该通路机制有望探索子宫腺肌病新的治疗策略。

目前AD的发病病因不明，研究多限于从患者或动物模型中检测不同因子在AD及对照组织中的表达情况。本研究同时从细胞学及组织学检测MMP-9、VEGF和COX-2在AD中的表达情况，同时对三者的相互关系进行研究，结果表明三者共同参与了AD发生发展，COX-2可能是AD发病的关键因子，有望成为治疗AD的分子靶点。本研究病例数也有一定局限性，尚需大样本量的研究进一步证实。