糖尿病肾病通过转录激活因子3诱导小鼠足细胞凋亡机制

梁顺 张鸿 杜玥 李中和 章斌 杜艺

1中山大学附属第五医院肾内科（广东珠海 519000）；2广东省人民医院肾内科广东省医学科学院（广州510080）

糖尿病肾病是导致终末期肾病的主要原因之一，其发病率在逐年上升［1］。越来越多的研究报道证实肾小球足细胞在糖尿病肾病的发病机制中具有重要作用［2-4］。体内外实验均表明高糖导致足细胞凋亡增加［5-6］，但足细胞凋亡机制尚未完全明确。国内外大量研究表明Yes相关蛋白（yesassociated protein，YAP）是足细胞凋亡生理拮抗剂，对保护足细胞具有重要作用［7-10］。转录激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）是具有亮氨酸拉链结构（bZIP）的转录因子，通过bZIP形成二聚体激活或抑制转录［11］。研究发现ATF3具有双重效应，在不同细胞中可促进或抑制细胞凋亡［12-13］，但在肾小球足细胞中的凋亡效应的相关研究报道甚少。本研究拟观察糖尿病小鼠模型肾组织足细胞和体外培养高糖（HG）刺激的足细胞中ATF3的表达情况，并探究ATF3对足细胞的凋亡效应，初步探究其凋亡机制与YAP的关系。

1 材料与方法

1.1仪器和试剂RMPI 1640培养基（CORNING）；0.05%胰酶、胎牛血清（Gibco）；γ干扰素（ProSpec）；核浆蛋白提取试剂盒（凯基）；Annexin V-APC/V450细胞凋亡检测试剂盒（BD Bioscience）；GAPDH抗体（Bioworld）；ATF3抗体（Abcam）；YAP、Histone、Bcl-2抗体（CST）；BAX、Synaptopodin抗体（Santa）；荧光二抗488、荧光二抗555（Thermo）；腺病毒GFP-ATF3（汉恒生物）；Trizol（Life Technologies）；逆转录试剂盒、SYBR GREEN（Takara）。

1.2足细胞的培养和实验分组条件永生化小鼠足细胞系由Rush University Medical Center惠赠。足细胞复苏后用含（2～4）×104U/L重组小鼠γ干扰素及10%胎牛血清（FBS）的RMPI 1640培养基先在33℃、5%CO2培养箱中增殖，细胞融合达到70%～80%时，用不含重组小鼠γ干扰素的5%FBS RMPI 1640培养基在5%CO2、37℃培养箱中分化培养。37℃培养10～12 d后，足细胞分化成熟。本实验所有足细胞实验均在分化成熟后进行。足细胞实验分组如下：（1）为明确HG诱导ATF3的时间效应，分组如下：HG（30 mmol/L）培养刺激0、1、2、4、6 h；（2）为探讨过表达ATF3对足细胞损伤的影响及其机制，分组如下：Vector组（给予转染GFP基因的腺病毒干预24 h，此为过表达实验的对照组）、ATF3组（给予转染GFP-ATF3基因的腺病毒干预24 h）；（3）为探究HG刺激下ATF3细胞核内表达，分组如下：Con组（未加干预对照组）、HG组（30 mmol/L HG干预2 h）。

1.3小鼠肾组织切片本研究所有动物实验都通过了广东省人民医院实验动物伦理管理委员会批准。db/db小鼠和同一遗传背景野生型（BKS）小鼠均购买于南京大学动物研究中心，饲养于中山大学北校区实验动物中心。小鼠被麻醉后（氯胺酮70 mg/kg腹腔注射），处死取肾脏组织做冰冻切片，保持于-80℃冰箱。

1.4免疫荧光将细胞或肾组织用冰甲醇固定、0.5%Triton X-100透化、5%胎牛血清蛋白封闭，然后滴加一抗过夜，避光加入相应的荧光二抗，封片，通过激光共聚焦显微镜观察。

1.5Western blot检测提取蛋白，测定蛋白浓度，加入变性液煮沸变性。蛋白经恒压80 V电泳，恒流200 mA、2 h电转到PVDF膜上，5%牛奶封闭，加入相应一抗二抗孵育，用化学发光液曝光，Image J软件分析灰度值。

1.6实时荧光定量PCRTrizol法提取细胞总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。按照SYBR Green PCR试剂盒说明书操作检测目的基因表达。每个样本设3个复孔，定量结果取平均值。引物序列见表1。

1.7流式细胞仪检测细胞凋亡收集各组细胞，用PBS洗一遍，用200 μL Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-APC 和 1 μL V450避光共孵育15 min，在1 h内用流式细胞仪检测。

1.8统计学方法符合正态分布计量资料用± s表示，组间比较用单因素方差分析，采用LSD检验进行两组间比较。采用统计软件SPSS 23.0进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1ATF3在db/db小鼠肾组织足细胞中表达增加通过组织免疫荧光染色，用肾小球足细胞标记蛋白Synaptopodin来定位足细胞，激光共聚焦显微镜观察，结果显示与对照BKS小鼠相比，糖尿病模型db/db小鼠的肾组织足细胞中ATF3的表达量明显增加。见图1。

图1 ATF3在db/db小鼠肾组织中表达增加（×400）Fig.1 ATF3 was upregulated in podocytes of db/db mouse（× 400）

2.2 HG刺激足细胞ATF3表达增加体外培养小鼠足细胞分化成熟后，用HG分别处理足细胞0、1、2、4、6 h。实时荧光定量 PCR 显示 ATF3 mRNA在1 h和2 h时明显增加（均P＜0.05），随后逐渐减少，到6 h基本恢复到基线水平（P＞0.05）。Western blot结果显示，ATF3蛋白在2 h时明显增加（1、2、4 h与0 h对比，均P ＜ 0.05），随后逐渐减少，到6 h基本恢复到基线水平（P＞0.05）。见图2。

图2 ATF3在高糖干预的足细胞中表达增加Fig.2 ATF3 was increased in high glucose（HG）-treated podoctes

2.3 过表达ATF3增加促进足细胞凋亡荧光定量PCR和Western印迹验证足细胞过表达效应，结果显示与Vector组相比ATF3组无论是mRNA水平还是蛋白水平，ATF3过表达效果都非常明显（均P＜0.05）。见图3a、3b。过表达足细胞ATF3后，通过Annexin V-APC/V450双染检测细胞凋亡情况，结果显示足细胞过表达ATF3后，凋亡比率明显增加（P ＜ 0.05）。见图3c、3d、3e。进一步检测凋亡相关因子BAX和Bcl-2表达，荧光定量PCR显示过表达足细胞ATF3后，促凋亡基因BAX表达上调，抗凋亡基因Bcl-2表达下调（均P＜0.05）。见图3f。Western blot结果显示过表达足细胞ATF3后，促凋亡蛋白BAX表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少（均P＜0.05）。见图3g。因此，ATF3表达增高后对足细胞具有促进凋亡效应。

2.4 HG刺激下诱导足细胞核ATF3表达增加HG刺激足细胞2 h后，通过足细胞骨架蛋白Synaptopodin定位足细胞，DAPI标记足细胞核，免疫荧光染色后结果显示，与Con组比较，HG组ATF3表达明显增加，且主要在细胞核内表达。见图4a。同样用HG刺激足细胞2 h后，提取足细胞核蛋白，通过Western blot检测细胞核内ATF3表达发现，与Con组相比，HG组足细胞核内ATF3蛋白表达量明显增加（P＜0.05）。见图4b。

图3 过表达ATF3促进足细胞凋亡Fig.3 Overexpression of ATF3 increased podocyte apoptosis

图4 高糖诱导足细胞核ATF3表达增加Fig.4 The translocation of ATF3 to the nucleus was increased in HG-treated podocytes

2.5 ATF3下调YAP表达过表达足细胞ATF3后，与Vector组相比，ATF3组中足细胞YAP mRNA表达减少（P＜0.05）。见图5a。同样，在过表达足细胞ATF3后，通过Western blot检测足细胞中YAP表达情况，结果显示与Vector组相比，ATF3组足细胞中YAP蛋白表达明显下调（P＜0.05）。见图5b。

图5 ATF3下调YAP表达Fig.5 ATF3 down-regulated the expression of YAP

3 讨论

近年来，随着全球经济发展，生活质量的提高，全世界的糖尿病尤其是2型糖尿病的发病率急剧增加［14］。世界卫生组织（WHO）预计，到2030年全球将有3.66亿糖尿病患者，占全球人口的4.4%［15］。糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一，是导致终末期肾病的主要原因。而目前对糖尿病肾病的发病机制仍未完全清楚，因此探究糖尿病肾病的发病机制是我们亟需解决的重任。近年来，多项研究表明足细胞的损伤在糖尿病肾病的发生发展中起关键作用［2-4］。足细胞，一种高度分化的上皮细胞，位于肾小球毛细血管网的外层，和基底膜、内皮细胞构成肾小球滤过屏障。足细胞病以蛋白尿为典型特征，几乎参与了所有肾小球疾病的病理改变，也是临床治疗的重要靶点［16］。因此阐明足细胞损伤机制具有重要意义。ATF3是转录因子ATF/CERB家族成员之一，具有DNA结合位点的亮氨酸拉链结构（bZIP）［17］，ATF3只有依靠其bZIP结构形成二聚体才能发挥作用［11］。在卵巢细胞［18］、胰岛细胞［13］、内皮细胞［19］中，ATF3的表达被证明是促进细胞凋亡的。然而在心肌细胞［12］、神经细胞［20］中ATF3具有抗凋亡效应。虽然ATF3在其他细胞中已得到大量的研究，对凋亡具有双向效应，但在高糖刺激性下足细胞中ATF3的表达情况及是否具有凋亡效应的研究甚少。

本研究在糖尿病小鼠模型中发现肾脏足细胞中有表达ATF3，且与对照非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠的足细胞中ATF3表达明显增多。因此本研究通过进一步体外实验，通过高糖干预足细胞，发现在高糖刺激下短时间内ATF3表达上调。无论在动物模型还是体外培养足细胞中，在高糖刺激下足细胞中ATF3表达量都上调。表达上调的ATF3是否对足细胞具有凋亡效应，需要通过进一步过表达足细胞中ATF3进行探究。研究表明当足细胞凋亡增加时，促凋亡因子BAX表达上调［5］，抗凋亡因子Bcl-2表达下调［21］。在本研究中，足细胞过表达ATF3后，通过流式细胞技术检测发现足细胞凋亡比率明显增加。进一步检测凋亡相关因子发现过表达足细胞ATF3后，足细胞BAX表达增加，Bcl-2表达减少。综上所述，高糖刺激足细胞中ATF3表达上调，高表达的ATF3对足细胞具有促凋亡作用。

为探究高糖刺激下增多的足细胞ATF3是如何实现凋亡效应的，进一步实验探究ATF3可能调控的相关因子。YAP是Hippo通路中最主要的转录因子之一，具有转录激活结构域而缺少DNA结合结构域，优先与具有DNA结合结构域的因子结合，介导下游靶基因的表达［22］。大量的研究表明YAP具有促细胞增殖，抗细胞凋亡的作用［23］。在肾脏方面，YAP在正常足细胞核内大量表达，是足细胞凋亡的生理拮抗剂，对保护足细胞，及糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化、慢性肾衰竭等的发生发展具有重要作用［10］。笔者团队前期研究发现HG处理的足细胞中也存在YAP的表达，且高糖刺激下足细胞凋亡增加，细胞核内的YAP表达减少［7］。本次研究发现ATF3在高糖的刺激下，主要在足细胞核内表达增多。高糖刺激下足细胞核内增多的促进凋亡的ATF3是否与细胞核内抑制凋亡的YAP相关仍待探讨。本研究首次探究ATF3与YAP之间的关联，在国内外研究中在尚无ATF3参与调控YAP的相关报道。通过过表达足细胞ATF3后检测足细胞中YAP的表达情况发现，无论是YAP的mRNA水平还是蛋白水平都在ATF3过表达后下调了。因此足细胞中ATF3参与调控YAP的表达，ATF3介导的凋亡效应是通过下调足细胞凋亡生理拮抗剂YAP实现的。

本研究发现高糖损伤下，足细胞中ATF3表达增加，表达上调的ATF3促进足细胞凋亡，其凋亡机制为高糖刺激下诱导细胞核内ATF3表达增加，ATF3通过下调足细胞核内凋亡生理拮抗剂YAP导致足细胞损伤。本研究对高糖损伤足细胞及糖尿病肾病的发生机制有一个新的认识，丰富了YAP抗足细胞凋亡信号通路。本研究后续还需进一步通过染色质免疫共沉淀实验深入探究ATF3是如何调控YAP，并通过体内实验验证ATF3与YAP的关系及对糖尿病肾病的影响，为ATF3应用于临床改善糖尿病肾病患者足细胞损伤和蛋白尿的发生提供更多理论依据。