白黎芦醇对宫颈癌Hela细胞中人程序化死亡分子5蛋白、mRNA表达的影响

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(郑州大学第一附属医院病理科、河南省肿瘤病理重点实验室，河南 郑州 450052)

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展是多基因、多因素共同参与的过程，随着对肿瘤发病机制的研究不断深入，发现恶性肿瘤的发生、发展及预后与细胞凋亡相关基因的改变密切相关。人程序化死亡分子5(human programmed cell death 5，PDCD5)基因在细胞的凋亡过程中起着关键性作用，在体外能抑制多种肿瘤细胞的生长，明显促进其凋亡[1]。白黎芦醇是从葡萄、花生、虎杖等药用植物中提取的有效成分，在体外能上调多种肿瘤细胞株中PDCD5的表达[2-4]，本实验旨在探讨PDCD5在宫颈癌Hela细胞中的表达及其与细胞凋亡的相关性，为宫颈癌的临床治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1材料人宫颈癌Hela细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院；白黎芦醇购自西安天行健生物公司；5’端生物素标记PDCD5 cDNA探针 (5’CGG CCA GCC TCT GTC TCC TCA 3’)购自北京奥科生物技术公司；PDCD5免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1 免疫细胞化学 采用免疫细胞化学检测宫颈癌Hela细胞中PDCD5蛋白表达，将宫颈癌Hela细胞进行分组，分别用25、50、100、200 μmol·L-1白藜芦醇处理宫颈癌Hela细胞24、48、72 h，以培养基代替白黎芦醇作为空白对照组；用已知PDCD5阳性表达的正常宫颈组织切片做阳性对照[5]。

1.2.2 原位杂交 采用原位杂交检测宫颈癌Hela细胞中PDCD5 mRNA表达，用RNase酶(0.1 g·L-1)预处理细胞滴片，酶解细胞内的mRNA，严格按操作步骤进行。用无探针的杂交液作为空白对照组，用已知PDCD5阳性表达的正常宫颈组织切片作为阳性对照。

1.2.3 免疫细胞化学和原位杂交结果判定 阳性信号均定位于宫颈癌Hela细胞的细胞质中，免疫细胞化学强阳性染色为黄褐色，原位杂交强阳性染色为紫蓝色，每张滴片随机选5个视野(100×)，按着色深浅和阳性细胞百分比来判定结果[5-7]：1)阳性细胞数：<1%为0分，1%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分；2)细胞着色强度的计分：无染色为0分，淡黄色或淡蓝色为1分，棕黄色或蓝色为2分，棕褐色或紫蓝色为3分。综合2项得分进行结果判定。

1.2.4 TUNEL法 采用TUNEL法检测宫颈癌Hela细胞凋亡情况，宫颈癌Hela细胞的细胞核呈黄褐色为凋亡阳性，细胞核不染色为阴性。以公式计算凋亡指数[6]。

2 结果

2.1白黎芦醇对宫颈癌Hela细胞中PDCD5蛋白、mRNA表达的影响4种不同浓度的白黎芦醇分别处理宫颈癌Hela细胞24、48、72 h后，与空白对照组比较，PDCD5蛋白、mRNA的表达均有明显升高，且白藜芦醇的浓度越高，其表达也越高，差异均有统计学意义(P均<0.05)；同一浓度白藜芦醇处理组中，随着时间延长，PDCD5蛋白、mRNA的表达也均升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

2.2白黎芦醇对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响4种不同浓度的白黎芦醇分别处理宫颈癌Hela细胞24、48、72 h后，与空白对照组比较，细胞凋亡指数明显增加，且随白藜芦醇的浓度的增加而升高，差异有统计学意义(P<0.05)；但同一浓度白藜芦醇处理组细胞凋亡指数随白藜芦醇的作用时间延长增加均不显著，差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表1 白黎芦醇对宫颈癌Hela细胞PDCD5蛋白、mRNA表达的影响

表2 白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

3 讨论

白藜芦醇属于多酚类化学物，在虎杖、花生、葡萄等植物内含量较高。有研究[8]证实白藜芦醇有抗炎、抗血小板聚集、清除自由基、抗氧化、心血管保护、诱导肿瘤细胞凋亡及抗肿瘤增殖等作用。关于白藜芦醇对肿瘤作用的研究[9]证实，白藜芦醇对乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、结肠癌等都有一定的抗肿瘤作用，可以抑制肿瘤细胞的生长并促进其凋亡。

细胞凋亡过程的紊乱与许多肿瘤的发生有直接或间接的关系。PDCD5基因在细胞的凋亡过程中起着关键性作用，可以诱导和促进凋亡。PDCD5在人体正常的睾丸、肾上腺、胎盘、肾脏等组织中高表达，而在胚胎组织、肿瘤组织中低表达或不表达[10]。

本实验中我们用不同浓度的白藜芦醇处理宫颈癌Hela细胞，不同时间段不同浓度白藜芦醇组PDCD5蛋白、mRNA表达均有增高，说明白藜芦醇可以通过上调宫颈癌Hela细胞中PDCD5的表达而促进肿瘤细胞凋亡。我们用TUNEL方法检测白藜芦醇处理宫颈癌Hela细胞凋亡情况，证实白藜芦醇可以提高宫颈癌Hela细胞的凋亡指数，说明白藜芦醇在体外可以促进宫颈癌Hela细胞凋亡。

综上所述，白藜芦醇可以通过上调宫颈癌Hela细胞中PDCD5的表达，促进和诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡，从而有望成为宫颈癌治疗新的辅助方法。