睾酮通过PI3K/mTOR信号通路促进子宫内膜癌细胞增殖的机制研究

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(1.常州市第一人民医院妇科，江苏 常州 213000；2.常州市第一人民医院综合实验室，江苏 常州 213000)

子宫内膜癌是严重威胁女性健康的妇科恶性肿瘤。最近的统计数据表明子宫内膜癌的发病率逐年上升，目前发病率位于妇科恶性肿瘤第4位[1]。子宫内膜癌的发生与多种因素相关[2]，睾酮可能是其中一种。睾酮是一种雄性激素，主要由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺也可以少量分泌[3-4]。睾酮具有多种生理学功能，但是最近的研究[5-7]表明，睾酮的表达水平与多种疾病的发生、发展和预后具有高度相关性，包括心血管疾病、抑郁症、肥胖以及前列腺癌等。但是目前关于睾酮与子宫内膜癌之间的相关性未有报道，因此本研究通过一系列实验探索睾酮对子宫内膜癌细胞增殖的影响以及其对PI3K/mTOR信号通路关键蛋白表达的影响[8]，以此探索子宫内膜癌潜在的治疗手段。

1 材料与方法

1.1细胞来源子宫内膜癌Ishikawa细胞株购自中国医学科学院上海细胞库。

1.2主要试剂睾酮购自江苏安特尔医疗科技有限公司，为口服用胶囊，用时取胶囊内液体进行稀释；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)、β-actin、PI3K、mTOR、p-PI3K、p-mTOR兔抗人一抗以及辣根过氧化物酶(HRP)偶联羊抗兔二抗购自美国CST公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Total RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒和SYRB购自日本TAKARA公司；DMEM F12培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gbico公司。

1.3方法

1.3.1 细胞培养 常规培养子宫内膜癌Ishikawa细胞于含有体积分数10%胎牛血清和质量分数1%青链霉素混合液的DMEM F12完全培养基中，置于细胞孵育箱内，保持37 ℃恒温，体积分数5% CO2浓度以及饱和湿度。在倒置显微镜下观察细胞密度，细胞生长至80%～90%密度进行消化传代。

1.3.2 细胞增殖检测(CCK-8法) 子宫内膜癌Ishikawa细胞消化重悬后以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，每组设置3个复孔，适应生长过夜后，加入终浓度为10、20、40、80 ng·mL-1的睾酮处理48 h，以未加睾酮的细胞作为阴性对照。加入体积分数10% CCK-8试剂共同孵育3 h后，置于酶标仪中在450 nm波长处检测各孔吸光度。

细胞如上铺板适应生长后，加入终浓度为40 ng·mL-1的睾酮处理7 d，每天同一时间按照上述方法检测1次吸光度值，以未加睾酮的细胞作为阴性对照，7 d后绘制细胞生长曲线。

1.3.3 qPCR法检测 子宫内膜癌Ishikawa细胞消化重悬后以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，适应生长过夜后，加入终浓度为40 ng·mL-1的睾酮处理48 h，以未加睾酮的细胞作为阴性对照，按照总RNA提取试剂盒说明书操作，提取细胞总RNA。吸光度法检测RNA浓度，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，构建cDNA。加入相应试剂和荧光染料SYRB后，用美国BIO-RED公司实时荧光定量PCR仪器进行检测，实验程序为：95 ℃预变性15 s；95 ℃变性5 s；65 ℃退火30 s；40个循环。最后结果以2-△△ct进行计算。实验重复3次。引物序列如下所示：β-actin：上游CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，下游GCTGTCACCTTCACCGTTCC；Bax：上游ACCAAGAAGCTGAGCGAGTG，下游CCCAGTTGAAGTTGCCATCA；Bcl-2：上游ACGACTTCTCCCGCCGCTAC，下游CCCAGCCTCCGTTATCCTG。

1.3.4 Western blot 子宫内膜癌Ishikawa细胞消化重悬后以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，适应生长过夜后，加入终浓度为40 ng·mL-1的睾酮处理48 h，以未加睾酮的细胞作为阴性对照，加入相应体积的RIPA-PMSF-磷酸酶抑制剂混合液提取细胞总蛋白。通过BCA法检测蛋白浓度，加入相应体积的上样缓冲液后煮沸5 min变性蛋白，于-20 ℃保存。配制SDS-PAGE凝胶后，以每孔30 μg的上样量加入变性蛋白溶液进行分离，转移进入PVDF膜上，使用质量分数5%牛血清白蛋白常温封闭2 h，切膜后分别加入已经稀释完毕的β-actin、Bcl-2、Bax、PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR兔抗人一抗，4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次后加入已经稀释完毕的HRP偶联羊抗兔二抗，室温孵育2 h。用TBST清洗3次后浸泡于TBST中，使用专用的ECL进行曝光。实验重复3次。最终以Actin作为内参，统计各组蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1不同浓度睾酮促进子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖常规培养子宫内膜癌Ishikawa细胞后，用不同浓度的睾酮处理，结果证实，睾酮以剂量依赖性的方式促进肿瘤细胞的增殖(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度睾酮对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的影响

2.2固定浓度睾酮显著促进子宫内膜癌Ishikawa细胞倍增时间常规培养子宫内膜癌Ishikawa细胞后，用40 ng·mL-1的睾酮处理5 d，结果证实，睾酮能够促进肿瘤细胞的增殖，降低其倍增时间(P<0.05)。见图1。

图1 睾酮作用不同时间对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的影响

2.3睾酮对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡相关基因表达的影响常规培养子宫内膜癌Ishikawa细胞后，用40 ng·mL-1的睾酮处理48 h，提取总蛋白和总RNA后，检测凋亡相关基因的表达水平。结果证实，无论是在转录水平还是翻译水平，睾酮都能够上调肿瘤细胞Bcl-2的表达水平，而降低Bax的表达水平。见图2、表2。

图2 睾酮对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡相关基因表达的影响

表2 睾酮对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡相关基因表达的影响

2.4睾酮对子宫内膜癌Ishikawa细胞PI3K/mTOR信号通路的影响常规培养子宫内膜癌Ishikawa细胞后，用40 ng·mL-1的睾酮处理48 h，提取总蛋白后，检测PI3K/mTOR信号通路活化水平。结果证实，睾酮能够促进肿瘤细胞PI3K和mTOR的磷酸化(P<0.05)。见图3、表3。

图3 睾酮对子宫内膜癌Ishikawa细胞PI3K/mTO信号通路蛋白活化的影响

表3 睾酮对子宫内膜癌Ishikawa细胞PI3K/mTOR信号通路蛋白活化的影响

注：与阴性对照组比较，1)P<0.05

3 讨论

子宫内膜癌是常见的妇科肿瘤，其发生与多种因素相关[9-11]。睾酮在多种恶性肿瘤，尤其是在前列腺癌的发生、发展中扮演了重要角色[5,7]。先前的研究[5,7,12]表明高水平的睾酮能够促进前列腺癌的发生以及骨转移，前列腺癌患者去势对于前列腺癌的治疗也具有重要意义。但是睾酮在妇科肿瘤，尤其是子宫内膜癌中的意义目前尚无报道，本研究旨在证实两者之间的联系并探索睾酮促进子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的效应和分子机制。

子宫内膜癌可以分为雌激素受体依赖型以及非依赖型[11]，雌激素受体依赖型以阳性表达雌激素受体为特征。子宫内膜癌Ishikawa细胞是雌激素受体依赖型子宫内膜癌的代表性细胞株[13-14]，本研究通过CCK-8法观察到不同浓度的睾酮能够提升子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖。使用固定浓度的睾酮作用于细胞不同时间，通过绘制的生长曲线可以发现，睾酮作用后显著缩短了细胞倍增时间，这初步证实了睾酮与子宫内膜癌之间的关联。

蛋白表达检测证实睾酮作用后显著上调了凋亡抑制基因Bcl-2的表达水平，显著下调了凋亡促进基因Bax的表达水平。该结果提示睾酮可能通过抑制细胞的凋亡而促进增殖，这与先前研究[15-16]相似。在更进一步的研究中，发现睾酮作用后PI3K/mTOR信号通路的关键分子p-PI3K和p-mTOR的活化水平显著上调，但是PI3K和mTOR的表达水平未受到影响，因此推测睾酮通过激活PI3K/mTOR信号通路促进Bcl-2的表达水平，同时抑制Bax的表达水平，最终促进子宫内膜癌子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖。